|
50 2.3.1.2. Получение специфической сыворотки к МПВ птиц Для получения гипериммунной сыворотки крови к метапневмовирусу птиц использовали клинически здоровых цыплят 20-суточного возраста, выращенных в камеральных условиях, свободных от антител к возбудителям вирусных болезней: ньюкаслская болезнь, инфекционный ларинготрахеит, инфекционный бронхит кур, инфекционная бурсальная болезнь и грипп птиц. Цыплят иммунизации очищенным метапневмовирусом штамма VC-03. Экспериментально показано, что оптимальным методом получения гипериммунной сыворотки крови кур является трехкратное введение птице метапневмовируса по схеме: двукратное введение метапневмовируса подкожно в объеме 0,5 см3 с интервалом в 7 сут. Третья иммунизация через 7 сут. подкожно в объеме 1,0 см3 инактивированного вируса с адъювантом. Подкожное введение антигена проводили в нижнюю треть шеи. Через 14 сут. после последней иммунизации цыплят тотально обескровливали путем взятия крови из сердца. Кровь разливали по 3-5см3 в пробирки, предварительно смоченные 0,85% раствором хлорида натрия. Пробирки маркировали с указанием номера птицы, даты взятия крови и ставили на 1 час в термостат при температуре 37°С . Сгусток крови обводили спицей и помещали в холодильник при 2-4°С на 16-18 часов для ретракции сыворотки. Полученную сыворотку крови расфасовали в стерильные флаконы. Активность гипериммунной сыворотки определяли в реакции нейтрализации в клетках Vero в (3-варианте по общепринятой методике. Специфическая сыворотка крови в PH имела тигр 8,0 log2, а в ИФА 1:5500. Таким образом, нами была получена положительная высокоактивная сыворотка крови к метапневмовирусу птиц. 2.3.1.3. Выделение специфических иммуноглобулинов Выделение IgG из иммунной сыворотки крови проводили сульфатнориваноловым методом. На первой стадии удатяли альбумин. К 0,3% водному |
47 суточного возраста, выращенных в камеральных условиях, свободных от антител к возбудителям вирусных болезней. Иммунизацию проводили путем введения нарастающих доз очищенного метапневмовируса птиц по следующей схеме (табл. 1). Таблица 1 Схема иммунизации цыплят js^n/n Материал и интервал между введениями Объем/гол., см3 Метод введения 1. первый день -введение очищенного метапне вмовиру са птиц 0,5 подкожно 2. 7-й день 1.0 подкожно 3. 21-й день 0,5 внутрибрюшинно 4. 35-й день обескровливание — Подкожное введение антигена проводили в нижнюю треть шеи. Внутрибрюшииное введение антигена метапневмовируса птиц осуществляли следующим образом. Птицу фиксировали за ноги вниз головой для того, чтобы кишечник сместился в грудино-брюшную полость. Затем в области, где заканчивается киль, отступя 2-3см от средней линии живота удаляли перо, и место инъекции обрабатывали 70%-ным этиловым спиртом. Проводили вкол 48 инъекционной иглой сквозь кожу и брюшинную стенку на глубину 0,5см и с помощью шприца инокулировали объем антигена. За иммунизированной птицей вели наблюдение. Через 14 дней после последней иммунизации цыплят тотально обескровливали путем взятия крови из сердца. Кровь разливали по 3~5см3 в пробирки, предварительно смоченные физиологическим раствором. Пробирки маркировали с указанием номера птицы, даты взятия крови и ставили на 1 час в термостат при температуре 37°С. Сгусток крови обводили спицей и помещали в холодильник при 2-4°С на 16-18 часов для ретракции сгустка. Полученную сыворотку крови сливали в стерильные флаконы. Активность полученных гиперпммунных сывороток определяли в реакции нейтрализации на культуре клеток куриных эмбрионов в (3-варианте по общепринятой методике. Результаты свидетельствовали о том; что гипериммунная сыворотка крови кур имела титр 8,0 log2. Таким образом, нами была получена положительная высокоактивная сыворотка крови кур к метапневмовирусу птиц*для ИФА. 2.2.1.3 Получение отрицательной сыворотки крови кур Для получения отрицательнойсыворотки крови использовали клинически здоровых цыплят 20-суточного возраста свободных от антител к возбудителям вирусных болезней птиц, в том числе к пиевмовирусу. Кровь разливали по 3-5 см3 в пробирки, предварительно смоченные физиологическим раствором. Пробирки маркировали с указанием номера птицы, даты взятия крови и ставили в термостат на 1 час при температуре 37°С. Сгусток крови обводили спицей и помещали в холодильник при 2-4°С на 16-18 часов для ретракции сгустка. Полученную сыворотку крови сливали в стерильные флаконы и проверяли на отсутствие антител к метапневмовирусу 70 по инфекционной активности. Активность метапневмовируса до очистки соответствовала 5,8±0,4 ig ГЦЦ 50/см3, а после очистки вирус был с активностью 4,8±0,5 lg ТЦЦ 50/см3. Таким образом, расчеты показали, что выход метапневмовируса по инфекционной активности составил 82,7%. Для получения специфической гипериммунной сыворотки крови кур к метапневмовирусу птиц использовали клинически здоровых цыплят 20-суточного возраста, выращенных в камеральных условиях, свободных от антител к возбудителям вирусных болезней. Схема иммунизации была основана на введении нарастающих доз очищенного метапнсвмовируса птиц. Активность полученной гипериммунной сыворотки контролировали в реакции нейтрализации на культуре клеток куриных эмбрионов в P-варианте. Гипериммунная специфическая сыворотка крови кур была высокоактивная и имела титр 8,0 logj. Отрицательную сыворотку крови кур получали от клинически здоровых кур 20-суточного возраста, выращенных в камеральных условиях, свободных от антител к возбудителям вирусных болезней птиц, в том числе к метапневмовирусу. Известно, что при разработке иммунофермеитных тест-систем необходимо проводить изучение влияния физико-химических факторов на чувствительность и специфичность ИФА (Е.Ы. Горбачев с соавт., 1988; Д.В. Маслов, 2006), что позволит оптимизировать условия постановки реакции при обнаружении специфических антител к метапневмовирусу птиц. Оптимизацию параметров постановки реакции для выявления антител к метаписвмовирусу птиц вели по иммуноспецифичсским и неспецифическим компонентам диагностической тест-системы. |