|
52 иммунопероксидазного конъюгата и сорбции на полистироловые планшеты для ИФА. 2.3.1.4. Получение иммунопероксидазного конъюгата кур Качество конъюгата зависело от высокой активности фермента и специфических иммуноглобулинов, соотношения фермента и иммуноглобулинов в конъюгате (показатель их связывания отношение оптической плотности иминовой основы фермента пероксидазы к оптической плотности общего белка конъюгата, коэффициент связывания ОГЪогЮГЬяо). С выделенными специфическими IgG из сыворотки крови к метапневмовирусу птиц и пероксидазой хрена производства «Serva», RS =3,0 было получено две серии иммунопероксидазных конъюгатов. При очистке конъюгатов на колонке с сефадексом G-200 от несвязавшейся пероксидазы были отобраны пиковые фракции с коэффициентом связывания от 0,4 до 0,6, так как именно при этом коэффициенте достигается оптимальное соотношение фермента с IgG в конъюгате, когда каждая молекула иммуноглобулина связана с одной или более молекулами пероксидазы. Конъюгаты пиковых фракций с показателем коэффициента связывания 0,4-0,6 были высокоактивными в противоположность конъюгатам с показателем коэффициента связывания ниже 0,4 (фракции левого и правого плеча), которые обладали низкой активностью, давали неспецифический фон и в работе не были использованы (рисунок 5). Жидкий конъюгат разливали по 0,2см3 в ампулы и высушивали в присутствии стабилизатора 1% бычьего сывороточного альбумина на аппарате типа В-71 фирмы «New Brunswick» (США) до конечной температуры в препарате 22-23°С, постоянного вакуума 11-12 мкр ртутного столба. Общее время лиофилизации не превышало 22-25 часов. Активность конъюгата проверяли в «сэндвич» варианте ИФА со специфическим иммуноглобулином G, который сорбировали в лунки |
55 Полученную сыворотку крови сливали в стерильные флаконы и проверяли на отсутствие антител к вирусу энтерита в реакции нейтрализации. Результаты показали, что исследуемая сыворотка крови не содержала антител к вирусу энтерита гусей. Таким образом, нами была получена отрицательная сыворотка крови гусей, которая была необходима: во-первых, для отрицательного контроля при постановке реакции ИФА; во-вторых, для получения антивидового иммунопероксидазного конъюгата. 3.2.1 А Получение антивидового иммунопероксидазного конъюгата Качество конъюгата зависело от высокой активности фермента и специфических иммуноглобулинов, соотношения фермента и иммуноглобулинов в конъюгате (показатель их связывания отношение оптической плотности иминовой основы фермента пероксидазы к оптической плотности общего белка конъюгата, коэффициент связывания ОП403/ОП280). В работе по получению конъюгата использовали препарат пероксидазы производства Олайнского НПО «Биолар», RZ = 2,7, который предварительно очищали на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой до RZ=3,0. При этом использовали одноступенчатый метод очистки пероксидазы. Собирали первую фракцию белка, определяли RZ. Результаты показали, что RZ первой белковой фракции был не ниже 3. Полученный одностадийной очисткой препарат превосходил по степени очистки и гомогенности пероксидазу хрена производства «Биолар». Очищенный в лабораторных условиях фермент давал одну доминантную полосу в электрофорезе и две слабовыраженные минорные полосы. Производственный препарат содержал три четко выраженные белковые полосы и несколько (около 4) минорных. RZ различных серий препарата после очистки колебалась от 3,0 до 3,8, а различные серии производственного препарата давали разброс от 2,7 до 3,0. 56 В качестве конъюгата использовали пиковые фракции с коэффициентом связывания от 0,4 до 0,6, т. к. именно при этом коэффициенте достигается оптимальное соотношение фермента с иммуноглобулинами в конъюгате, когда каждая молекула иммуноглобулина связана с одной или более молекулами пероксидазы. Конъюгаты пиковых фракций с показателем коэффициента связывания 0,4-0,6 были высокоактивными в противоположность конъюгатам с показателем коэффициента связывания ниже 0,4 (фракции левого и правого плеча), которые обладали низкой активностью, давали неспецифический фон и в работе не были использованы (рис. 2). Конъюгат лиофилизировали в присутствии 1% бычьего сывороточного альбумина и проверяли исходную активность в прямом методе ИФА. Активность конъюгата составила 1:6000. Для лиофильно высушенного конъюгата подбирали оптимальное рабочее разведение в ИФА, так как от правильно выбранного рабочего разведения иммуноглобулинового конъюгата зависит результат реакции. При разработке диагностической тест-системы ИФА для выявления специфических антител к парвовирусу гусей одну ампулу лиофилизированного конъюгата разводили 1:20 (рабочее разведение). В наших экспериментах рабочее разведение конъюгата составило 1:300-1:400. Жидкий конъюгат разливали по 0,2см3 в ампулы и высушивали в присутствии стабилизатора 1% бычьего сывороточного альбумина на аппарате типа В-71 фирмы «New Brunswick» (США) до конечной температуры в препарате 22-23°С, постоянного вакуума 11-12 мкр ртутного столба. Общее время лиофилизации не превышало 22-25 часов. Субстратом служила 5-аминосалициловая кислота (5-АСК), высокоочищенная (99%), производства США. В работе использовали планшеты для иммуноферментного анализа производства Biohit, Финляндия. 89 обнаружено, что предварительная очистка производственного препарата пероксидазы на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой повышала активность фермента. RZ различных серий препарата после очистки колебалась от 3,0 до 3,8, в то время как различные серии производственного препарата давали разброс от 2,7 до 3,0. При электрофорезе в ПААТ исходный препарат пероксидазы содержал 4 фракции, тогда как очищенный в лабораторных условиях фермент давал одну доминантную полосу и две слабовыраженные минорные полосы. Этот факт свидетельствует о том, что очищенная пероксидаза была электрофоретически гомогенна. На стадии очистки конъюгата от несвязавшихся белков и пероксидазы использовали пиковые фракции с коэффициентом связывания от 0,4 до 0,6 (рис. 2), так как именно при этом коэффициенте достигается оптимальное соотношение фермента с иммуноглобулином в конъюгате, когда каждая молекула иммуноглобулина связана с одной или более молекулами пероксидазы. Активность конъюгата в прямом методе ИФА была 1:6000. Экспериментально было установлено, что рабочее разведение конъюгата 1:300 1:400 является оптимальным в непрямом методе ИФА для обнаружения специфических антител к вирусу энтерита гусей. Известно, что при разработке диагностических тест-систем необходимо проводить изучение влияния физико-химических факторов на чувствительность и специфичность ИФА (Е.Н. Горбачев с соавт., 1988). Оптимизацию параметров постановки реакции при обнаружении специфических антител к вирусу энтерита гусей вели по иммуноспецифическим и неспецифическим компонентам диагностической тест-системы. Установлено, что оптимальной сенсибилизирующей дозой парвовирусного антигена явилась концентрация 5-8 мкг на лунку (рис. 3), при которой значения экстинкции достигали максимума. При этом кривая линия |