|
53 полистиролового планшета в течение 2 часов при 37°С или 16-18 часов при 4-8°С в 0,05М карбонат-бнкарбонатном буфере pH 9,5-9,7 с концентрацией 5,0 мкг/см3 и трижды отмывали 0,01 М калий-фосфатным буфером, содержащим 0,5М раствор Рисунок 5. Выбор активных фракций для конъюгата 1 показатели оптической плотности фракций при длине волны 280 нм 2показатели оптической плотности при длине волны 403 нм 4-6 активные фракции конъюгата. хлорида натрия с 0,1% конечной концентрацией твина-20, pH 7,2±0,2 (ФБРТ), добавляя в каждую лунку не менее 0,2 см\ Затем вносили контрольный антиген МПВ в десятикратных разведениях, начиная с разведения 1:10 до 1:10к, который инкубировали 60 минут при 37°С. Конъюгат вносили в разведениях близких к предварительно оттитрованным. За рабочее разведение конъюгата принимали концентрацию, при которой выявляли контрольный антиген МГ1В в наибольшем |
47 Для определения конкретного оптимального рабочего разведения антивидового конъюгата поверхность лунок полистиролового планшета сенсибилизировали очищенным антигеном вируса энтерита гусей в разведении 1:5. После 18-20 часовой экспозиции и трехкратного отмывания в лунки планшета вносили сыворотки (положительную и отрицательную) в разведениях от 1:50 до 1:6400, которые инкубировали 30 минут при 37°С. Антивидовой конъюгат вносили в разведениях близких к предварительно оттитрованным. За рабочее разведение конъюгата принимали концентрацию, при которой выявляли антитела позитивной сыворотки в наибольшем разведении при минимальном фоне неспецифического окрашивания в лунках с негативной сывороткой. В наших опытах рабочее разведение полученных антивидовых конъюгатов варьировало от 1:300 до 1:500. В очищенном препарате вируса, в конъюгате и промежуточных продуктах его получения и очистки, концентрацию белка определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951), используя в качестве стандартного раствора бычий сывороточный альбумин (БСА, производства НИИЭМ, Беларусь). 3.1.3.6 Постановка непрямого метода ИФА для обнаружения специфических антител к вирусу энтерита гусей Для сенсибилизации поверхности лунок полистироловых планшет для ИФА (производства Biohit, Финляндия) использовали очищенный антиген вируса энтерита гусей в оптимальной концентрации, разведенный 0,01М фосфатно-буферным раствором с 0,15М NaCl pH 7,2±0,2. Иммобилизацию антигена на поверхности лунок полистироловых планшет осуществляли в течение 18-20 часов при температуре 4-8°С. Несвязавшийся с поверхностью полистирола антиген отмывали трехкратно в объеме 0,2см3 0,01М калий-фосфатным буфером, содержащим 0,5М раствор хлорида натрия с 0,1% конечной концентрацией твина-20, pH 7,2±0,2 ФБРТ. Планшеты для |