|
54 разведении при минимальном фоне неспецифического окрашивания в лунках, не содержащих определенный антиген или содержащих гетерологичный антиген. В наших опытах рабочее разведение полученных конъюгатов варьировало от 1:1500 до 1:3000. 2.3.2. Разработка иммунофсрментной тест-системы для выявления антигена метапневмовируса птиц 2.3.2.1. Определение оптимальных концентраций и условий взаимодействия компонентов В основе многоэтапной процедуры постановки ИФА лежат специфическое (иммунохимическое) и неспецифическое (адсорбционное) взаимодействия. Иммунохимическое взаимодействие между иммунологически активными компонентами иммуноферментной системы (антиген-антитело) обуславливает специфичность тест-системы. С одной стороны, неспецифические взаимодействия типа «твердая фаза-белок» определяют активность твердофазного иммуносорбента; с другой стороны, неспецифические взаимодействия типа «белок-белок» приводят к появлению фонового сигнала. Оба типа взаимодействия находятся в прямой зависимости от физико-химических факторов: температура, ионная сила и значение pH реакционной среды, продолжительность взаимодействия, концентрационные соотношения, которые, как следствие, влияют на чувствительность и специфичность иммуноферментного анализа. При создании любой диагностической тест-системы необходимо проводить изучение влияния физико-химических факторов на чувствительность и специфичность ИФА [13,27] и делать выбор на этой основе оптимальных параметров постановки реакции при обнаружении антигена метапневмовируса птиц. |
57 Рис. 2. Выбор активных фракций для конъюгата —•— показатели оптической плотности фракций при длине волны 280 нм; • • • показатели оптической плотности фракций при длине волны 403 нм; УУААвыбранные фракции. Сыворотки крови гусей получали из ООО «Катайский гусеводческий комплекс» Курганской области и фермерских хозяйств Ленинградской области. 3.2.2 Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления специфических антител к парвовирусу гусей В основе многоэтапной процедуры постановки ИФА лежат специфическое (иммунохимическое) и неспецифическое (адсорбционное) взаимодействия. Иммунохимическое взаимодействие между 58 иммунологически активными компонентами иммуноферментной системы (антиген-антитело) обуславливают специфичность тест-системы. С одной стороны, неспецифические взаимодействия типа «твердая фаза-белок» определяют активность твердофазного иммуносорбента; с другой стороны, неспецифические взаимодействия типа «белок-белок» приводят к появлению фонового сигнала. Оба типа взаимодействия находятся в прямой зависимости от физико-химических факторов: температура, ионная сила и значение pH реакционной среды, продолжительность взаимодействия, концентрационные соотношения, которые, как следствие, влияют на чувствительность и специфичность иммуноферментного анализа. При создании любой диагностической тест-системы необходимо проводить изучение влияния физико-химических факторов на чувствительность и специфичность ИФЛ (Е.Н. Горбачев с соавт., 1988) и делать выбор на этой основе оптимальных параметров постановки реакции при обнаружении специфических антител к парвовирусу гусей. 3.2.2.1 Определение сенсибилизирующих доз антигена При подборе оптимальной сенсибилизирующей дозы парвовирусного антигена руководствовались рекомендациями исследователей и необходимости индивидуального подбора концентрации антигена для каждой тест-системы. Выбор оптимальной концентрации очищенного вируса энтерита гусей проводили в диапазоне от 10 мкг/см3 до 100 мкг/см3 при продолжительности сорбции 18 часов при 4°С. Адсорбцию антигена вели в 0,01М натрийфосфатном буфере с содержанием 0,15М хлорида натрия, pH 7,2-7,4. После отмывания планшета в лунки вносили положительную и отрицательную сыворотки в разведении 1:50 и инкубировали со связавшимся с поверхностью полистирола антигеном в течение 60 минут при 37°С. Затем лунки планшета освобождали от содержимого путем встряхивания и трехкратно промывали ФБРТ в объеме 0,2см3. После тщательной очистки лунок от несвязавшихся |