|
55 2.3.2.1 Л. Определение сенсибилизирующих доз метапневмовирусных антител Оптимизацию тест-системы на основе «сэндвич» варианта ИФА для обнаружения антигена металневмовируса птиц в биологическом материале вели по иммуноспецифическим и неспецифическим компонентам. Для получения активного твердофазного иммуносорбента использовали планшеты фирмы «Nunc» (США). В ходе отработки условий получения активного твердофазного иммуносорбента оценивали влияние концентрации иммуноглобулинов G, температуры и значения pH реакционной среды и продолжительности сорбции. Выбор оптимальной концентрации специфических антител проводили в диапазоне от 0,5 мкг/см3 до 10 мкг/см3 при продолжительности сорбции в течение 1 6 1 8 часов при 4°С в 0,05 М карбонат-бикарбонатном буфере, pH 9,59,7. После отмывания планшета в лунки вносили контрольный очищенный антиген МПВ птиц в разведении 1:10 и инкубировали со связавшимися с поверхностью полистирола антителами в течение 90 минут при 37°С. Затем лунки планшета освобождали от содержимого путем встряхивания и трехкратно отмывали ФБРТ в объеме 0,2 см3. После тщательной очистки лунок от несвязавшегося антигена вносили конъюгат в рабочем разведении и помещали с термостат на 60 минут. После чего конъюгат удаляли, лунки трехкратно отмывали и подсушивали путем постукивания, перевернутым планшетом по фильтровальной бумаге. Учет результатов реакции вели через 25 минут после внесения субстратно-индикаторной смеси, по изменению величины экстинкции конечного продукта реакции. Сенсибилизирующая активность антител была различной (рисунок 6). Как видно на рисунке 6, зависимое от концентрации антиметапневмовирусных антител связывание антигена происходит в пределах IgG от 1,0 до 5,0 мкг/см3 . При этом изолинии выходили на «плато», что свидетельствует о насыщении поверхности лунок белком. Дальнейшее увеличение концентрации антител (более 8,0 мкг/см3 на лунку) не приводило к |
58 иммунологически активными компонентами иммуноферментной системы (антиген-антитело) обуславливают специфичность тест-системы. С одной стороны, неспецифические взаимодействия типа «твердая фаза-белок» определяют активность твердофазного иммуносорбента; с другой стороны, неспецифические взаимодействия типа «белок-белок» приводят к появлению фонового сигнала. Оба типа взаимодействия находятся в прямой зависимости от физико-химических факторов: температура, ионная сила и значение pH реакционной среды, продолжительность взаимодействия, концентрационные соотношения, которые, как следствие, влияют на чувствительность и специфичность иммуноферментного анализа. При создании любой диагностической тест-системы необходимо проводить изучение влияния физико-химических факторов на чувствительность и специфичность ИФЛ (Е.Н. Горбачев с соавт., 1988) и делать выбор на этой основе оптимальных параметров постановки реакции при обнаружении специфических антител к парвовирусу гусей. 3.2.2.1 Определение сенсибилизирующих доз антигена При подборе оптимальной сенсибилизирующей дозы парвовирусного антигена руководствовались рекомендациями исследователей и необходимости индивидуального подбора концентрации антигена для каждой тест-системы. Выбор оптимальной концентрации очищенного вируса энтерита гусей проводили в диапазоне от 10 мкг/см3 до 100 мкг/см3 при продолжительности сорбции 18 часов при 4°С. Адсорбцию антигена вели в 0,01М натрийфосфатном буфере с содержанием 0,15М хлорида натрия, pH 7,2-7,4. После отмывания планшета в лунки вносили положительную и отрицательную сыворотки в разведении 1:50 и инкубировали со связавшимся с поверхностью полистирола антигеном в течение 60 минут при 37°С. Затем лунки планшета освобождали от содержимого путем встряхивания и трехкратно промывали ФБРТ в объеме 0,2см3. После тщательной очистки лунок от несвязавшихся 59 антител вносили конъюгат в рабочем разведении и помещали с термостат на 60 минут. После чего конъюгат удаляли, лунки трехкратно промывали и подсушивали путем постукивания перевернутым планшетом по фильтровальной бумаге. Учет результатов реакции вели через 20 минут после внесения субстратно-индикаторной смеси, по изменению величины экстинкции конечного продукта реакции. Сенсибилизирующая активность антигена была различной (рис. 3). Как видно из рис. 3, что оптимальной сенсибилизирующей дозой парвовирусного антигена явилась концентрация 5-8 мкг на лунку, при которой значения экстинкции достигали максимума. При этом кривая линия выходила на «плато», что свидетельствовало о насыщении поверхности лунок вирусным белком. Дальнейшее увеличение концентрации антигена (более 8,0 мкг на лунку) не приводило к возрастанию емкости твердофазного иммунособрента. При концентрации белка менее 5 мкг/0,1см3 имело место значительное снижение величины экстинкции и, как следствие, уменьшение чувствительности анализа. Кроме того, на последующих этапах ИФА это могло привести к повышению фонового сигнала вследствие неспецифической сорбции молекул конъюгата на свободных поверхностях полистирола. 3.2.2.2 Определение pH сорбирующего буфера Существенным параметром, влияющим на чувствительность ИФА, является pH сорбирующей буферной системы. По данным литературы известно, что для фиксации различных вирусных антигенов используется две системы: 0,01М натрий-фосфатный буфер с 0,15 М NaCI (pH 7,2-7,4) и натрий-карбонатный буфер (pH 9,6). В работе по выявлению парвовируса гусей в патматериале методом ИФА авторы (М. Фадель и др., 1989) использовали карбонатно-бикарбонатный буфер с pH 9,6. Для обнаружения вируса болезни Держи у гусей и антител к нему авторы также использовали |