|
56 возрастанию емкости твердофазного иммунособрента. При концентрации белка менее 0,5 мкг/см3 имело место значительное снижение величины экстинкции и, как следствие, уменьшение чувствительности анализа. Кроме того, на последующих этапах ИФА это могло привести к повышению фонового сигнала вследствие неспецифической сорбции молекул конъюгата на свободных поверхностях полистирола. Рисунок 6. Определение сенсибилизирующих доз антител в ИФА • По оси абсцисс концентрация IgG; • По оси ординат значения оптической плотности при длине волны 492 нм. 1.Показатель оптической плотности (ОП) антигемотрицательной культуральной жидкости. 2. Показатель ОП контрольного антигена (очищенный концентрированный штамм VC-03 МГ1В птиц); 2.3.2.1.2. Определение pH сорбирующего буфера Существенным параметром, влияющим на чувствительность ИФА, является pH сорбирующей буферной системы. По данным литературы известно, что для фиксации различных антител в основном используется натрий-карбонатный буфер (pH 9,6). При выборе оптимального значения pH сорбирующей буферной |
59 антител вносили конъюгат в рабочем разведении и помещали с термостат на 60 минут. После чего конъюгат удаляли, лунки трехкратно промывали и подсушивали путем постукивания перевернутым планшетом по фильтровальной бумаге. Учет результатов реакции вели через 20 минут после внесения субстратно-индикаторной смеси, по изменению величины экстинкции конечного продукта реакции. Сенсибилизирующая активность антигена была различной (рис. 3). Как видно из рис. 3, что оптимальной сенсибилизирующей дозой парвовирусного антигена явилась концентрация 5-8 мкг на лунку, при которой значения экстинкции достигали максимума. При этом кривая линия выходила на «плато», что свидетельствовало о насыщении поверхности лунок вирусным белком. Дальнейшее увеличение концентрации антигена (более 8,0 мкг на лунку) не приводило к возрастанию емкости твердофазного иммунособрента. При концентрации белка менее 5 мкг/0,1см3 имело место значительное снижение величины экстинкции и, как следствие, уменьшение чувствительности анализа. Кроме того, на последующих этапах ИФА это могло привести к повышению фонового сигнала вследствие неспецифической сорбции молекул конъюгата на свободных поверхностях полистирола. 3.2.2.2 Определение pH сорбирующего буфера Существенным параметром, влияющим на чувствительность ИФА, является pH сорбирующей буферной системы. По данным литературы известно, что для фиксации различных вирусных антигенов используется две системы: 0,01М натрий-фосфатный буфер с 0,15 М NaCI (pH 7,2-7,4) и натрий-карбонатный буфер (pH 9,6). В работе по выявлению парвовируса гусей в патматериале методом ИФА авторы (М. Фадель и др., 1989) использовали карбонатно-бикарбонатный буфер с pH 9,6. Для обнаружения вируса болезни Держи у гусей и антител к нему авторы также использовали |