|
57 системы исследовали натрий-ацетатный буфер pH 4,2; фосфатный буфер pH 7,2-7,4; натрий-карбонатный буфер pH 9,5-9,7 и 11,0. Полистироловые планшеты дня ИФА сенсибилизировали специфическими антителами в концентрации 1,0 мкг/мл при продолжительности сорбции в течение 16 18 часов при 4°С. Было установлено, что интенсивность реакции в указанном диапазоне варьировала, достигая максимума при pH 9,5-9,7, при котором величина экстинкции превышала экстинкцию при нейтральных pH (рисунок 7). Полученные данные свидетельствовали о том, что при pH 9,5-9,7 адсорбция антител на поверхности полистирола была выше, чем при pH 7,2-7,4. При сдвигах pH в щелочную (11,0), гак и в кислую (4,2) стороны, величины экстинкции снижались, по-видимому, за счет частичной денатурации белка и уменьшения специфической активности. 0.8 0,7 0.6 * 0.5 м 5 0.4 Е о 0.3 0.2 0.1 0 7,2-7,4 9,5-9,7 11 L 4,2 7.2-7,4 ■ 9.S-9.7 □И pH Рисунок 7. Влияние pH сорбирующей буферной системы По оси абсцисс показатели pH сорбирующих буферных систем: 1 натрий-ацетатный буфер pH 4,2; 2 фосфатный буфер pH 7,2-7,4; 3 натрий-карбонатный буфер pH 9,5-9,7; 4 pH 11. По оси ординат показатели оптической плотности контрольного антигена МПВ птиц при длине волны 492нм. |
61 карбонатный буфер в методах двойной сэндвич ELISA и блокирующий вариант ELISA (V. Kardi, Е. Szegletes, 1996). При выборе оптимального значения pH сорбирующей буферной системы исследовали натрий-ацетатный буфер pH 4,2; фосфатный буфер pH 7,2-7,4; натрий-карбонатный буфер pH 9,6 и 11,0. Полистироловые планшеты для ИФА сенсибилизировали очищенным антигеном. Было установлено, что интенсивность реакции в указанном диапазоне варьировала, достигая максимума при pH 9,6, при котором величина экстинкции превышала экстинкцию при pH 7,2-7,4 (рис. 4). Полученные данные свидетельствовали о том, что при pH 9,6 адсорбция антигена на поверхности полистирола была выше, чем при pH 7,2-7,4. При сдвигах pH в щелочную (11,0), так и в кислую (4,2) стороны, величины экстинкции снижались, по-видимому, за счет частичной денатурации белка и уменьшения по специфической активности (Е.Н. Горбачев и др., 1988). Однако, учитывая тот факт, что очистку вируса проводили на фосфатном буфере pH 7,2-7,4, то и для адсорбции парвовирусного антигена выбрали это значение. 3.2.2.3 Определение времени и температуры сорбции парвовирусного антигена Влияние продолжительности инкубации и температуры на фиксацию антигена изучали с использованием оптимальной концентрации очищенного вируса в фосфатном буфере pH 7,2-7,4. Сенсибилизацию полистироловых планшет антигеном проводили при 4°, 20°, 37° и 56°С в течение 2 и 18 часов (рис. 5). Изучение кинетики сорбции показало, что при температурах 4° и 20°С полное насыщение поверхности твердой фазы антигеном происходило через 18 часов, тогда как при температуре 37°С время сорбции сокращалось до 2 часов. По-видимому, с увеличением температуры происходило увеличение коэффициента диффузии белка и время достижения равновесия уменьшалось. |