|
58 2.3.2Л.3. Определение времени и температуры сорбции антиметапневмовирусных антител Влияние продолжительности инкубации и температуры на фиксацию специфических антител изучали с использованием оптимальной концентрации иммуноглобулинов G в 0,05 М карбонат-бикарбонатном буфере, pH 9,5-9,7. Сенсибилизацию полистироловых планшет иммуноглобулинами G проводили при 4°, 20°, 37° и 56°С в течение 2 и 18 часов (рисунок 8). Изучение кинетики сорбции показало, что при температурах 4° и 20°С полное насыщение поверхности твердой фазы антиметапневмовирусными антителами происходило через 16-18 часов, тогда как при температуре 37°С время сорбции сокращалось до 2 часов. По-видимому, с увеличением температуры происходило увеличение коэффициента диффузии белка и время достижения равновесия уменьшалось. Следует отметить, что при температуре 56°С полное насыщение поверхности полистирола антителами также наступало через 2 часа, но при этом наблюдалось резкое снижение специфичности. Специфичность диагностической тест-системы определяли по отсутствию реакции с антигенотрицательной культуральной жидкостью. Исходя из полученных данных нами был сделан вывод о том, что наиболее оптимальным режимом сенсибилизации полистироловых планшет иммуноглобулинами G является инкубация при 4°С в условиях бытового холодильника в течение 16-18 часов. Анализируя данные по оптимизации условий получения твердофазного иммуносорбента для «сэндвич» варианта ИФА необходимо учитывать природу полимера, используемого в качестве твердой фазы. По данным литературы известно, что полистирол характеризуется большей сорбционной емкостью по сравнению с поливинилацетатом и другими носителями. Отечественные полистироловые планшеты по сравнению с зарубежными, обладают низкой сорбционной активностью. Поэтому в ходе отработки условий получения активного твердофазного иммуносорбента использовали планшеты зарубежного производства. |
61 карбонатный буфер в методах двойной сэндвич ELISA и блокирующий вариант ELISA (V. Kardi, Е. Szegletes, 1996). При выборе оптимального значения pH сорбирующей буферной системы исследовали натрий-ацетатный буфер pH 4,2; фосфатный буфер pH 7,2-7,4; натрий-карбонатный буфер pH 9,6 и 11,0. Полистироловые планшеты для ИФА сенсибилизировали очищенным антигеном. Было установлено, что интенсивность реакции в указанном диапазоне варьировала, достигая максимума при pH 9,6, при котором величина экстинкции превышала экстинкцию при pH 7,2-7,4 (рис. 4). Полученные данные свидетельствовали о том, что при pH 9,6 адсорбция антигена на поверхности полистирола была выше, чем при pH 7,2-7,4. При сдвигах pH в щелочную (11,0), так и в кислую (4,2) стороны, величины экстинкции снижались, по-видимому, за счет частичной денатурации белка и уменьшения по специфической активности (Е.Н. Горбачев и др., 1988). Однако, учитывая тот факт, что очистку вируса проводили на фосфатном буфере pH 7,2-7,4, то и для адсорбции парвовирусного антигена выбрали это значение. 3.2.2.3 Определение времени и температуры сорбции парвовирусного антигена Влияние продолжительности инкубации и температуры на фиксацию антигена изучали с использованием оптимальной концентрации очищенного вируса в фосфатном буфере pH 7,2-7,4. Сенсибилизацию полистироловых планшет антигеном проводили при 4°, 20°, 37° и 56°С в течение 2 и 18 часов (рис. 5). Изучение кинетики сорбции показало, что при температурах 4° и 20°С полное насыщение поверхности твердой фазы антигеном происходило через 18 часов, тогда как при температуре 37°С время сорбции сокращалось до 2 часов. По-видимому, с увеличением температуры происходило увеличение коэффициента диффузии белка и время достижения равновесия уменьшалось. 63 Следует отметить, что при температуре 56°С полное насыщение поверхности полистирола антигеном также наступало через 2 часа, но при этом наблюдалось резкое снижение специфичности. Специфичность диагностической тест-системы определяли по отсутствию реакции с отрицательной сывороткой крови гусей. Исходя из полученных данных нами был сделан вывод о том, что наиболее оптимальным режимом сенсибилизации полистироловых планшет парвовирусным антигеном является инкубация при 4°С в условиях бытового холодильника в течение 18 часов. Анализируя материалы по оптимизации условий получения твердофазного иммуносорбента для ИФА необходимо учитывать природу полимера, используемого в качестве твердой фазы. По данным литературы известно, что полистирол характеризуется большей сорбционной емкостью по сравнению с пол и вин ил ацетатом и другими носителями (Herrmann, Collins, 1976). Однако выпускаемые в настоящее время зарубежные и отечественные полистироловые планшеты существенно отличаются друг от друга по своим сорбционным характеристикам. Отечественные полистироловые планшеты по сравнению с зарубежными, обладают низкой сорбционной, активностью (Г.В. Резапкин и др., 1986). Поэтому в ходе отработки условий получения активного твердофазного иммуносорбента использовали зарубежные полистироловые планшеты производства Biohit Финляндия. 3.2.2.4 Определение времени и температуры инкубации сывороток с адсорбированным парвовирусным антигеном Существенную роль на данном этапе ИФА играет установление константы равновесия между иммобилизированным на поверхности полистирола антигеном и антителами и на последующем этапе между 90 выходила на «плато», что свидетельствует о насыщении поверхности лунок полистироловых планшет вирусным белком. Существенным параметром, влияющим на чувствительность ИФЛ, является pH сорбирующей буферной системы. По данным литературы известно, что для обнаружения вируса болезни Держи и антител, выработанных против него методами двойной сэндвич ELISA и блокирующий вариант ELISA авторы использовали карбонатный буфер, pH 9,6 (Kardi, Szegletes, 1996). Результаты проведенных нами исследований показали, что при pH 9,6 адсорбция парвовирусного антигена была выше, чем при pH 7,2-7,4 (рис. 4). Однако учитывая тот факт, что очистку вируса проводили на фосфатном буфере с pH 7,2-7,4, то и для адсорбции вируса энтерита гусей выбрали его. Влияние продолжительности инкубации и температуры на фиксацию антигена изучали с использованием оптимальной концентрации очищенного вируса в фосфатном буфере pH 7,2-7,4. Было установлено, что наиболее оптимальным режимом сенсибилизации полистироловых планшет антигеном вируса энтерита является инкубация при 4°С в условиях бытового холодильника в течение 18 часов (рис. 5). Анализ результатов по оптимизации условий получения активного твердофазного иммуносорбента для ИФА показал значимость природы полимера, используемого в качестве твердой фазы. По данным литературы известно, что полистирол характеризуется большей сорбционной емкостью по сравнению с другими носителями (Herrman, Collins, 1976). Однако выпускаемые в настоящее время зарубежные и отечественные полистироловые планшеты существенно отличаются друг от друга по своим сорбционным характеристикам. Данные литературы (Г.В. Резапкин и др., 1986) и результаты собственных исследований показали, что отечественные планшеты (Ленмедполимер, г.Санкт-Петербург) обладают низкой сорбционной активностью по сравнению с зарубежными. Поэтому в ходе отработки условий получения |