|
60 Определение оптимального режима инкубации антигенсодержащего материала с адсорбированными на планшетах иммуноглобулинами G проводили при температурах 20° и 37°С в течение 60, 90 и 120 минут (рисунок 9). В таком же режиме проводили и инкубацию конъюгата. Из рисунка 6 видно, что равновесие в системе наступает практически через 90 минут при температуре 20°С, при температуре 37°С аналогичная картина уже наблюдалась через 60 минут, величины экстинкции были на одном уровне. Увеличение экспозиции до 90 минут сопровождалось возрастанием величин экстинкции на 15-20%, а при экспозиции 120 мин величины экстинкции еще больше возрастали, но при этом отмечался рост «фонового» окрашивания. Результаты оценки кинетики связывания конъюгата свидетельствовали, что изолинии достигали «плато» в течение 60—90 мин. При этом достаточная чувствительность ИФА была обеспечена уже при 60 мин инкубации. Увеличение инкубации до 90 мин. сопровождалось возрастанием величин экстинкции только на 5—10%, при этом отмечался рост «фонового» окрашивания. Ряд авторов использовали, с целью сокращения продолжительности иммуноферментного анализа, предварительное прогревание всех реагентов до 37°С на каждом этапе. Однако при этом происходит снижение чувствительности не менее чем в 10 раз [1]. Кроме того, прогрев не контролируем, что нарушает стабильность и воспроизводимость результатов. Для ИФА авторы рекомендуют, чтобы температурные различия находились в пределах ±0,1 °С [183]. Предусматривая стабильность и воспроизводимость результатов ИФА, при постановке иммуноферментной реакции вируссодержащий материал инкубировали в термостате при 37°С в течение 90 минут, а иммунопероксидазный конъюгат в тех же условиях в течение 60 мин. |
65 образовавшимся иммунным комплексом (антиген-антитело) и иммунопероксидазным конъюгатом. Определение оптимального режима инкубации сывороток крови гусей с адсорбированным на планшетах парвовирусным антигеном проводили при температурах 20° и 37°С в течение 30, 45 и 60 минут (рис. 6). В таком же режиме проводили и инкубацию конъюгата. Результаты исследований, представленные на рис. 6, показали, что равновесие в системе наступает практически через 45 минут при температуре 20°С, при температуре 37°С аналогичная картина уже наблюдалась через 30 минут, величины экстинкции были на одном уровне. Увеличение инкубации до 60 минут сопровождалось возрастанием величин экстинкции на 15-20%, но при этом отмечался рост «фонового» окрашивания. Ряд авторов использовал с целью сокращения продолжительности иммуноферментного анализа предварительное прогревание всех реагентов до 37°С на каждом этапе. Однако при этом происходит снижение чувствительности не менее чем в 10 раз (З.М. Андреева и др., 1985). Кроме того, прогрев не контролируем, что нарушает стабильность и воспроизводимость результатов. Для ИФА авторы рекомендуют, чтобы температурные различия находились в пределах ±0,1° (Oliver et al., 1981). Предусматривая стабильность и воспроизводимость результатов ИФА, при постановке иммуноферментной реакции сыворотки крови гусей и иммунопероксидазный конъюгат инкубировали в термостате при 37°С в течение 30 минут. 3.2.2.5 Определение специфичности иммуноферментного анализа В твердофазных иммуноферментных анализах специфичность определяется минимальным «фоновым» сигналом, обусловленным неспецифическими взаимодействиями примесных (на этапе инкубации исследуемых сывороток) и избыточных компонентов (на этапе инкубации |