Проверяемый текст
Маслов Дмитрий Владимирович. Серологическая диагностика вирусного энтерита гусей методом иммуноферментного анализа (Диссертация 2007)
[стр. 61]

61 Рисунок 9.
Определение влияния времени и температуры инкубации антигенсодержащего материала с адсорбированными антиметапневмовирусными антителами 1показатели ОП492 антигенсодержащей культуральной жидкости в разведении 1:10 при t 37°С; 2 показатели ОП492 антигенсодержащей культуральной жидкости в разведении 1:10 при t 20°С; 3 показатели ОП492 антигенотринательной культуральной жидкости в разведении 1:10; при t 37°С; 4 показатели ОП492 антигенотрицательной культуральной жидкости в разведении 1:10; при t 20°С.
2.3.2.1.5.
Определение специфичности иммуноферментного анализа В твердофазных иммуноферментных анализах специфичность определяется минимальным «фоновым» сигналом, обусловленным неспецифическими взаимодействиями примесных (на этапе инкубации исследуемых
образцов) или избыточных компонентов (на этапе инкубации конъюгата).
Для устранения неспецифических взаимодействий как типа «твердая фаза—белок», так и типа «белок—белок», используются промывочные буферные системы, включающие
[стр. 66]

65 образовавшимся иммунным комплексом (антиген-антитело) и иммунопероксидазным конъюгатом.
Определение оптимального режима инкубации сывороток крови гусей с адсорбированным на планшетах парвовирусным антигеном проводили при температурах 20° и 37°С в течение 30, 45 и 60 минут (рис.
6).
В таком же режиме проводили и инкубацию конъюгата.
Результаты исследований, представленные на рис.
6, показали, что равновесие в системе наступает практически через 45 минут при температуре 20°С, при температуре 37°С аналогичная картина уже наблюдалась через 30 минут, величины экстинкции были на одном уровне.
Увеличение инкубации до 60 минут сопровождалось возрастанием величин экстинкции на 15-20%, но при этом отмечался рост «фонового» окрашивания.
Ряд авторов использовал с целью сокращения продолжительности иммуноферментного анализа предварительное прогревание всех реагентов до 37°С на каждом этапе.
Однако при этом происходит снижение чувствительности не менее чем в 10 раз (З.М.
Андреева и др., 1985).
Кроме того, прогрев не контролируем, что нарушает стабильность и воспроизводимость результатов.
Для ИФА авторы рекомендуют, чтобы температурные различия находились в пределах ±0,1° (Oliver et al., 1981).
Предусматривая стабильность и воспроизводимость результатов ИФА, при постановке иммуноферментной реакции сыворотки крови гусей и иммунопероксидазный конъюгат инкубировали в термостате при 37°С в течение 30 минут.
3.2.2.5 Определение специфичности иммуноферментного анализа В твердофазных иммуноферментных анализах специфичность определяется минимальным «фоновым» сигналом, обусловленным неспецифическими взаимодействиями примесных (на этапе инкубации исследуемых сывороток) и избыточных компонентов (на этапе инкубации

[стр.,92]

91 активного твердофазного иммуносорбента использовали зарубежные полистироловые планшеты производства Biohit, Финляндия.
Существенную роль в ходе постановки ИФА играет установление константы равновесия между иммобилизированным на поверхности полистирола антигеном и антителами и на последующем этапе между образовавшимся иммунным комплексом (антиген-антитело) и конъюгатом.
Было установлено, что равновесие в системе наступает практически через 30 минут при температуре 37°С.
Увеличение инкубации до 60 минут при данной температуре сопровождалось возрастанием величин экстинкции на 15-20%, но при этом отличался рост «фонового» окрашивания (рис.
6).
Поэтому, учитывая стабильность и воспроизводимость результатов ИФА, при постановке реакции исследуемые сыворотки крови гусей и иммунопероксидазный конъюгат инкубировали в термостате при 37°С в течение 30 минут.
В твердофазных иммуноферментных анализах специфичность определяется минимальным «фоновым» сигналом, обусловленным неспецифическими взаимодействиями
такими, как «твердая фаза-белок» и «белок-белок».
Для устранения неспецифического взаимодействия используют промывочные буферные системы, включающие неионный детергент (твин-20) и иммунологически инертный белок до 1-2% или наряду с детергентом вводят в промывочный раствор высокую концентрацию хаотропных ионов типа С1 (В.Н.
Вербов, 1988; Е.Н.
Горбачев с соавт., 1988).
Результаты сравнительной оценки промывочных буферных систем показали, что фосфатный буфер pH 7,2-7,4, содержащий 0,5М NaCl с 0,1% конечной концентрацией детергента твин-20 обеспечивает специфичность иммуноферментного анализа (табл.
1).
Таким образом, проведенные исследования по изучению влияния физико-химических факторов на чувствительность и специфичность ИФА

[Back]