|
птиц подтипа В [199]. Метапневмовирус штамма VC-03 репродуцировали в клетках Vero [48]. Максимальное накопление вируса происходило через 120-144 часа после заражения, инфекционный титр вируса составил 5,7 lg ЦПД5о/1,0 см3, что согласуется с данными И.А. Борисовой, [5]; Б.Б. Трефилова, [52]; Patnayak et al., [193]. Очистку метапневмовируса проводили гельфильтрацией на макропористом стекле, модифицированном ПВП [42], с предварительным осветлением культуральной жидкости центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 минут. Осаждение метапневмовируса методом ультрацентрифугирования при 75000 g в течение 1,5 часов позволило сконцентрировать ВСМ в 10 раз и полностью без потерь осадить метапневмовирус. Подбирая размер диаметра пор стекла, концентрации и pH элюирующего буфера, количества наносимого ВСМ и высоты колонки установили, что, используя МПС с диаметром пор ЮООА, 0,01 М ФБР, pH 7,3-7,5 и количество наносимого вирусного материала равное 1/10 части препаративной колонки происходило оптимальное разделение вирусного и примесного белка (рисунок 4)[31 ]. По внешнему виду очищенный антиген метапневмовируса птиц представлял собой прозрачную опалесцирующую жидкость, без хлопьев и осадка. Очистка вируса составила 98,7%, с концентрацией белка 60-80 мг в 1,0 см3. Во всех вариантах ИФА, в которых метке подвергаются антитела, специфичность сыворотки является одним из главных условий для успешного проведения такого рода работ [229]. Для получения специфической гипериммунной сыворотки крови кур к метапневмовирусу птиц использовали клинически здоровых цыплят 20-суточного возраста, выращенных в камеральных условиях, свободных от антител к возбудителям вирусных болезней. Схема иммунизации была основана на введении нарастающих доз очищенного метапневмовируса птиц. Специфическая активность сыворотки составила 8,0 log2 в реакции нейтрализации в клетках Vero в [3-варианте и 1:4000 в ИФА. 71 |
45 культуральные матрасы встряхивали и клеточный детрит осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную вируссодержащую жидкость исследовали на инфекционную активность. Определение инфекционного титра метапневмовируса проводили в пробирочной культуре клеток по ТЦД. Посевная концентрация клеток составила 750 тыс. кл/см3. После формирования монослоя из пробирок удаляли ростовую среду, однократно промывали раствором Хенкса и вносили вирус в разведениях от 10'1 до 10'6, в объеме 0,2 см3, по 4 пробирки на каждое разведение. Результаты оценивали по ЦПД через 3-5 суток после заражения клеток и рассчитывали титр вируса по методу Рида и Менча. Инфекционный титр вируса составил 5,8±0,4 lg ТЦД50/см3. Для получения концентрированного вируссодержащего материала (ВСМ) был использован метод дифференциального центрифугирования. Вирус из предварительно осветленной культуральной жидкости осаждали при 75000 g в течение 1,0, 1,5 и 2,0 часов. Результаты исследований показали, что метод ультрацетрифугировапия позволяет концентрировать ВСМ в 10 раз и полностью без потерь осадить метапневмовирус в течение 1,5 часов. Осадок ресуспендировали в 5,0 см3 фосфатно-солевого буфера. ВСМ очищали методом молекулярно-ситовой хроматографии на МПС путем подбора размера диаметра пор стекла, концентрации и pH элюирующего буфера и количества наносимого вирусного материала. Результаты исследований показали, что очистка концентрированного ВСМ, используя МПС с диаметром пор lOOOAf, 0,01 М ФБР, pH 7,3-7,5 и количество наносимого вирусного материала равное 1/10 части препаративной колонки, приводила к оптимальному разделению вирусного и примесного белка. По внешнему виду очищенный антиген метапневмовируса птиц представлял собой прозрачную опалесцирующую жидкость, без хлопьев и 69 положительной и отрицательной сывороток крови и антивидового иммуноиероксидазного конъюгата, специфичного к IgG кур. Метапневмовирус штамма VC-03 репродуцировали на перевиваемой линии клеток почки африканской зеленой мартышки (клетки Vero) и в культуре клеток СПФ-эмбрионов кур. Максимальное накопление вируса происходило через 120-144 часа после заражения, инфекционный титр вируса составил 5.7 Ig ЦПД5о/1,0 см3, что согласуется с данными И.Л. Борисовой (2008), Б.Б'. Трефилова, JI. 10. Данко (2010), Patnayak et al.(2005). При выборе эффективных методов очистки метапневмовируса мы остановились на традиционном способе очистки вирусов гельфильтрацией на макропористом стекле модифицированном ПВП (В.Д. Сергеев, И.К. Рождественский, 1988), с предварительным осветлением культуральной жидкости центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 минут и концентрированием метапневмовируса методом ультрацентрифугирования при 75000 g в течение 1,5 часов, что позволило сконцентрировать ВСМ в 10 раз и полностью без потерь осадить метапневмовирус. Очистку вируса методом молекулярно-ситовой хроматографии проводили путем подбора размера диаметра пор стекла, концентрации и pH элюирующего буфера, количества наносимого вирусного материала и высоты колонки. Установлено, что при очистке концентрированного ВСМ, используя МПС с диаметром пор 1000А, 0,01 М ФБР, pH 7,3-7,5 и количество наносимого вирусного материала равное 1/10 части препаративной колонки приводило к оптимальному разделению вирусного и примесного белка (рис. 3). По внешнему виду очищенный антиген мегапневмовируса птиц представлял собой прозрачную опалесцирующую жидкость, без хлопьев и осадка. Очистка вируса составила 98,7%, с концентрацией белка 60-80 мг в 1,0 см3. Вторым показателем степени очистки вируса был его выход 70 по инфекционной активности. Активность метапневмовируса до очистки соответствовала 5,8±0,4 ig ГЦЦ 50/см3, а после очистки вирус был с активностью 4,8±0,5 lg ТЦЦ 50/см3. Таким образом, расчеты показали, что выход метапневмовируса по инфекционной активности составил 82,7%. Для получения специфической гипериммунной сыворотки крови кур к метапневмовирусу птиц использовали клинически здоровых цыплят 20-суточного возраста, выращенных в камеральных условиях, свободных от антител к возбудителям вирусных болезней. Схема иммунизации была основана на введении нарастающих доз очищенного метапнсвмовируса птиц. Активность полученной гипериммунной сыворотки контролировали в реакции нейтрализации на культуре клеток куриных эмбрионов в P-варианте. Гипериммунная специфическая сыворотка крови кур была высокоактивная и имела титр 8,0 logj. Отрицательную сыворотку крови кур получали от клинически здоровых кур 20-суточного возраста, выращенных в камеральных условиях, свободных от антител к возбудителям вирусных болезней птиц, в том числе к метапневмовирусу. Известно, что при разработке иммунофермеитных тест-систем необходимо проводить изучение влияния физико-химических факторов на чувствительность и специфичность ИФА (Е.Ы. Горбачев с соавт., 1988; Д.В. Маслов, 2006), что позволит оптимизировать условия постановки реакции при обнаружении специфических антител к метапневмовирусу птиц. Оптимизацию параметров постановки реакции для выявления антител к метаписвмовирусу птиц вели по иммуноспецифичсским и неспецифическим компонентам диагностической тест-системы. |