|
73 молекула иммуноглобулина связана с одной или более молекулами пероксидазы. Активность конъюгата в прямом методе ИФА была 1:24000. Экспериментально было установлено, что рабочее разведение конъюгата 1:3000 является оптимальным в «сэндвич» варианте ИФА для выявления антигена мегапневмовируса птиц в биологическом материале. Известно, что при разработке твердофазных количественных иммунотестов необходимо проводить изучение влияния физико-химических факторов на чувствительность и специфичность ИФА [13,27]. Влияние физико-химических факторов на чувствительность и специфичность ИФА контролировали по изменению величин экстинкции конечного продукта реакции, при варьировании различных параметров постановки реакции. Кроме того, оценивали значимость буферных и промывочных систем. Твердофазный иммуносорбент получали путем физической сорбции специфических антиметапневмовирусных иммуноглобулинов G (Н + L), механизм которой заключается во взаимодействии гидрофобных участков молекул с гидрофобной поверхностью твердой фазы за счет Ван-дер-Ваальсовых сил, при этом учитывали природу полимера, используемого в качестве твердой фазы. Известно, что полистирол характеризуется большей сорбционной емкостью по сравнению с другими носителями. Однако выпускаемые в настоящее время зарубежные и отечественные полистироловые планшеты существенно отличаются друг от друга по своим сорбционным характеристикам. Результаты собственных исследований показали, что отечественные планшеты (Ленмедполимер, г. СанктПетербург) обладают низкой сорбционной активностью по сравнению с зарубежными. Поэтому в данной работе использовали 96-луночные полистироловые планшеты фирмы «Nunc» (США). В ходе отработки условий получения активного твердофазного иммуносорбента оценивали влияние концентрации иммуноглобулинов G (Н + L), температуры, и значения pH реакционной среды, продолжительности сорбции. Оптимальной сенсибилизирующей дозой антиметапневмовирусных антител явилась концентрация IgG (Н + L), от 1,0 до 5,0 мкг/см3. При этом изолинии |
71 Анализ литературных данных по оптимизации условий получения активного твердофазного иммуносорбента для ИФА показал значимость природы полимера, используемого в качестве твердой фазы (Д.В.Маслов, 2006). Известно, что полистирол характеризуется большей сорбционной емкостью по сравнению с другими носителями (Herrman, Collins, 1976). Однако выпускаемые в настоящее время зарубежные и отечественные полистироловые планшеты существенно отличаются друг от друга по своим сорбционным характеристикам. Данные литературы (Г.В. Резапкин и др., 1986) и результаты собственных исследований показали, что отечественные планшеты (Ленмедполимер, г. Санкт-Петербург) обладают низкой сорбционной активностью по сравнению с зарубежными. Поэтому для получения активного твердофазного иммуносорбента в нашей работе использовали планшеты зарубежных фирм. Рабочее разведение антигена было определено методом «шахматного» титрования на поверхности лунок полистироловых планшет в фосфатно-солевом буферном растворе, рН=7,3-7,5, в течение 16-18 часов при температуре 4°С с разведением контрольных сывороток 1:400. Оптимальной сенсибилизирующей дозой метапневмовирусного антигена явилась концентрация 6-8 мкг на лунку. Оптимальное рабочее разведение лиофилизированного коммерческого конъюгата подбирали экспериментально. В наших экспериментах рабочее разведение коныогата составило 1:300-1:400. В качестве субстрата использовали ортофенилендиамин («Sigma») в концентрации 5 мг на 12 см3 фосфа гноцитратного буфера, рН=4,9-5,0. 13 процессе постановки реакции исследуемые и контрольные сыворотки, конъюгат инкубировали в термостате при 37°С в течение 30 минут, так как по данным литературы известно, что установление константы равновесия между иммобилизированным на поверхности полистирола антигеном и антителами и на последующем этапе между |