|
75 комплексом (антитело—антиген) и иммунопероксидазным конъюгатом [45]. При использовании очищенного штамма VC-03 метапневмовируса установлено, что равновесие в системе наступало практически при температуре 37°С через 90 мин. При проведении экспериментов с биологическими материалами имели место аналогичные результаты (рисунок 9). Результаты оценки кинетики связывания конъюгата свидетельствовали, что изолинии достигали «плато» в течение 60—90 мин. При этом достаточная чувствительность ИФА была обеспечена уже при 60 мин инкубации. Увеличение инкубации до 90 мин. сопровождалось возрастанием величин экстинкции только на 5—10%, при этом отмечался рост «фонового» окрашивания [311 Таким образом, для получения достоверных и воспроизводимых результатов ИФА при постановке иммуноферментной реакции вируссодержащий материал инкубировали в термостате при 37°С в течение 90 минут, а иммунопероксидазный конъюгат в тех же условиях в течение 60 мин. Для устранения неспецифического взаимодействия в ходе ИФА используют промывочные буферные системы, включающие неионный детергент (твин-20) и иммунологически инертный белок до 1-2% или наряду с детергентом вводят в промывочный раствор высокую концентрацию хаотропных ионов типа СГ [8,13,27], Твин-20, как поверхностно активный реагент, препятствует неспецифической сорбции. Инертные белки, обладая большей по сравнению с иммуноглобулинами сорбционной способностью, блокируют свободные поверхности твердой фазы [83]. На основании результатов сравнительной оценки в настоящей тест-системе в качестве промывочного буфера использовали фосфатно-солевой буфер, pH 7,27,4, содержащий 0,5 М NaCl с 0,1% конечной концентрацией детергента твин-20, который обеспечивал специфичность иммуноферментного анализа. [31] Специфичность диагностической тест-системы была подтверждена отсутствием реакции с антигенотрицательной культуральной жидкостью и с гетерологичными антигенами антигеном ИЛТ и ИБК. |
72 образовавшимся иммунным комплексом (антиген-антитело) и конъюгатом наступает практически через 30 минут при температуре 37°С (Е.Н. Горбачев с соавт., 1988; Д.В.Маслов, 2006). Для устранения неспецифического взаимодействия в ходе ИФА используют промывочные буферные системы, включающие неионный детергент (твин-20) и иммунологически инертный белок до 1-2% или наряду с детергентом вводят в промывочный раствор высокую концентрацию хаотропных ионов типа С1~ (В.Н. Вербов, 1988; Е.Н. Горбачев с соавт., 1988; Д.В.Маслов, 2006). Нами был использован 0,01М калий-фосфатный буфер рН=7,2-7,4, содержащий 0,5М NaCl с 0,1% конечной концентрацией детергента твин-20, который обеспечивал специфичность иммуноферментного анализа. Таким образом, проведенные исследования позволили оптимизировать условия постановки реакции при обнаружении специфических антител к метапневмовирусу птиц. Диагностический титр в ИФА устанавливали методом «шахматного титрования» различных сывороток, начиная с разведения 1:100, при стандартной концентрации (6 мкг на лунку) сорбированного антигена. Анализ полученных результатов показал, что разведение сывороток 1:400 дает возможность не пропустить слабоположительные сыворотки. При этом 20 сывороток крови из благополучных по метапневмовирусной инфекции птиц хозяйств были отрицательными в ИФА, что подтверждает специфичность разработанной диагностической тест-системы. В связи с этим при обследовании птицеводческих хозяйств на метапневмовирусную инфекцию считаем, что целесообразно начинать постановку ИФА с разведения сыворотки 1:100 и считать разведение сыворотки 1:400 диагностическим титром на метапневмовирусную инфекцию птиц. |