|
101 вания из каждого органа достаточно 3 срезов [628]. При использовании микроскопа Triton с целью изучения показателей структурной организации исследуемых органов (использование объектива с увеличением X 4) конечная площадь тестового квадрата была равна 3600 мкм2 (сторона квадрата 60 мкм), при подсчете цитограммы клеток (применение объектива с увеличением X 40) 36 мкм2 (сторона квадрата 6 мкм). При применении микроскопа Axioimager площади тестовых квадратов были равны 14400 мкм2 (сторона 120 мкм) и 144 мкм2 (сторона 12 мкм), соответственно [157]. В процессе морфометрических исследований на срезе лимфатических узлов определяли относительную площадь капсулы, соединительнотканных прослоек в корковом и мозговом веществе, краевого синуса, коркового плато, паракортекса, лимфоидных фолликулов без центров и с центрами размножения, мякотных тяжей и мозговых синусов. Дифференцирование кровеносных и лимфатических сосудов проводили в соответствии с рекомендациями J.Casley-Smith [428, 429], J.R.Head, L.L.Seeling [628] и В.И.Козлова с соавт. [121]. Для изучения цитограммы клеток (лимфоцитов, иммунои плазмобластов, нейтрофилов, эозинофилов, эритроцитов, моноцитов, макрофагов, тканевых базофилов (тучных клеток), плазматических, делящихся клеток, клеток Мотта и клеток с деструктивными изменениями) определяли от 500 до 1000 клеток в различных местах препарата, в зависимости от однородности клеточного состава. Приняв общее количество клеток за 100%, определяли относительное содержание каждого типа, типы клеток верифицировали в соответствии с рекомендациями М.Г.Абрамова [1], Ю.И.БородинаиВ.Н.Григорьева [38]. Лимфатические узлы из секционного материала невозможно было использовать для изучения клеточного состава различных зон в связи с процессами, происходящими в заключительном периоде жизни больного или здорового организма. Минимальных терминальных изменений в лимфатических узлах можно избежать путем забора материала при быстрой гибели здорового организма, но даже мгновенная смерть не фиксирует с абсолютной точностью прижизненное состояние органов и тканей. После остановки сердца происходят беспоря |
80 Для непрямого стрсгтгавиднн-биотшгопого метода замороженные срезы, после метаноловок фиксации и промывания буфером Пако (3 раза по 10 мин.), инкубировали с amn-CD38 мышиными антителами (Dako) в течение 30 мин. во влажной камере. Полученные комплексы, после промывания буфером Dako (3 раза но 10 мин.), во влажной камере обрабатывали антителами (biotinylated ЛВreagent against mouse and rabbit, Dako) в течение 30 мни. После промывания буфером Dako (3 раза по 10 мин.) (пункты 1-6 процедуры постановки реакции совпадают при пероксидазном и стрсптавидии-биттшовом методах), продукты реакции на срезах обрабатывали в следующей последовательности: 7. Реакция со Streptavidine alkaline phosphatase (Dako) во влажной камере в течение 30 мин. 8. Промывание буфером Dako (3 раза по 5 мин.). 9. Промывание водой дня остановки реакции. Препараты докрашивали гемалауном Майера и после дегидратации заключали в Emelian. Срезы изучали на световых микроскопах Triton (Scti, Бельгия) и Carl Zeiss (Германия) при увеличении до 2500 раз. Выбор подвздошных лимфатических узлов сделан на основании рекомендаций ЮМ.Бородина с соавт. (1982, 1986, 1987а, 19876, !987в, 1988, 19896, 1990а, 19906, 1990в, 1991а, 19916, 1992а, 19926, 1999а) и Н.Д.Скляновон с соавт. (1987), так как различными методами было доказано, что лимфа от тела матки крыс оттекает в различные подвздошные лимфатические узлы. Определение структурной организации различных отделов исследуемых органов проводили при увеличении светового микроскопа до 1200 раз. Применяли квадратную тестовую систему, совмещаемую на экране компьютера с изображением, полученным при помощи цифровой видеокамеры микроскопа. Для изучения показателе»! структурной организации лимфатических узлов (использование объектива с увеличением X 10) конечная площадь тестового квадрата была равна 3600 мкм2 (сторона квадрата 60 мкм), при подсчете цитограммм клеток (применение объектива с увеличением X 40) 36 мкм2(сторона квадрата 81 6 мкм) (Майбородин И.В. и др., 2003а). С каждого среза проводили 3-5 измерений, в связи с рекомендациями, что для рандомизированного исследования из матки каждого животного достаточно 3 срезов (Head J.R., Seeling L.L., 1984). 23,Статпстпчсскаи обработка полученных данных. Морфометрическое исследование структуры различных отделов матки, тонкой и толстой кишки, солитарных фолликулов и фолликулов Пейеровых бляшек, брыжеечных и подвздошных лимфатических узлов проводили в соответствии с рекомендациями, изложенными в многочисленных работах, посвященных теоретическому обоснованию и конфетным примерам применения этих методов (Глаголев А.А., 1941а, 19416; Шахламов В.А.., 1967; Катинас Г.С., Полонский Ю.З., 1970; Плохинский Н.А., 1970; Вейбедь Э.Р., 1970; Автандилов Г.Г., 1973, 1980, 2002; Христолюбопа Н.Б., Шилов А.Г., 1974; Weibcl H.R., 1979; Автандилов Г,Г. и др., 1981, 1984; Непомнящих JI.M. и др., 1986; Горчаков В.Н., 1997). Обозначение и размерность стсрсологичсскнх параметров, использованных в работе, приведены согласно рекомендациям Международного стереологического общества (Weibcl E.R., 1979). В процессе морфометрических исследований па срезе органов определяли относительную площадь кровеносных и лимфатических сосудов, интерстициальных пространств, клеток л межклеточного вещества в собственной пластинке слизистой и мышечной оболочках матки; собственной пластинке слизистой, подслизистой и мышечной оболочках толстой кишки; герминативных центров и мантийной зоны в солитарных агрегированных фолликулах; коркового плато, паракортекса, лимфоидных фолликулов без центров и с центрами размножения, мякотных тяжей и мозговых синусов в брыжеечных и подвздошных лимфатических узлах. Дифференцирование кровеносных и лимфатических сосудов проводили в соответствии с рекомендациями J.R.Head, L.L.Seeling (1984) и В.И.Козлова с соавт. (1994). Кроме того, рассчитывали количество эпителиальных клеток на 100 мкм |