|
99 шечные и параректальные лимфатические узлы) биоптированные объекты фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина не менее 24 часов, обезвоживали в серии этанола возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заключали в парафин. Срезы толщиной 7-10 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, азуром В и эозином, по Ван-Гизон и по Романовскому [83, 137, 192, 234]. В процессе морфологических исследований в каждой группе больных женщин определяли частоту встречаемости аксиллярных лимфатических узлов, в которых полностью отсутствовало мозговое вещество: было замещено различными типами соединительной ткани. При необходимости более точного определения структуры изучаемых органов изготовляли серийные срезы через 50 мкм по 10 мкм. Кроме этого, из замороженных парапульмонарных лимфатических узлов пациентов готовили криостатные срезы толщиной 4-5 мкм, высушивали на воздухе в течение 30-60 мин., фиксировали в метаноле 10 мин. при -20°С и трижды по 5 мин. промывали в фосфатном буфере. Далее срезы окрашивали aHrra-CD38 антителами непрямым иммунопероксидазным или, как более специфичным, непрямым стрептавидин-биотиновым методом. В обоих случаях использовали набор реагентов "Dako reagents kit" (Dako, Дания): Непрямая иммунопероксидазная реакция: 1. Иинкубация с раствором перекиси водорода (Dako) 30 мин. для подавления эндопероксидазной активности. 2. Промывание буфером Dako (3 раза по 5 мин.). 3. Инкубация с anra-CD38 мышиными антителами (Dako) в течение 30 мин. во влажной камере. 4. Промывание буфером Dako (3 раза по 5 мин.). 5. Инкубация вторыми антителами (goat anti mouse/rabbit, Dako), меченными пероксидазой, во влажной камере в течение 30 мин. при 37°С. 6 . Промывание буфером Dako (3 раза по 5 мин.). 7. Визуализация продуктов реакции на срезах 3,3-диамидобензидином, как суб |
79 жает сохранять приоритет одного из основных инструментов для практической медицины и ученых различных специальностей (Бредбери С.Д. и др,, 1992). Тело матки, фрагменты тонкой и толстой кишки крыс, забранные на расстоянии 5-7 см от слепой кишки, Пеперовы бляшки, иижиие брыжеечные и общие подвздошные (nodi lymphatic! iliaci communes) лимфатические узлы фиксировали в 4% растворе параформальдегида на фосфатном буфере (pH 7,4) не менее 24 часов, обезвоживали в серии этанола возрастающей конце!пграции, просветляли в ксилоле и заключали в парафин. Срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и по Романовскому (Пирс Э., 1964; Елисеев В.Г. и др., 1967; Лилли Р., 1969; Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996). Кроме этого, из замороженных иараиульмонарных лимфатических узлов namieirroB готовили криостатные срезы толщиной 4-5 мкм, высушивали на воздухе в течение 30-60 мин., фиксировали в метаноле 10 мин. при -20°С п трижды по 5 мин. промывали в фосфатном буфере. Далее срезы окрашивали airm-CD38 аггштсламн непрямым иммунопсроксидазным или, как более специфичным, непрямым стрсптавцщш-бнотшювым методом. R обоих случаях использовали набор реагентов "Dako reagents kit" (Dako; Дания): Непрямая иммунопсроксидазная реакция: 1. Иинкубация с раствором перекиси водорода (Dako) 30 мин. для подавления эндопсрокс!глазной активности. 2. Промывание буфером Dako (3 раза по 5 мин,). 3. Инкубация с анти-СШ8 мышиными антителами (Dako) в течение 30 мин. ro влажной камере. 4. Промывание буфером Dako (3 раза по 5 мин.). 5. Инкубация вторыми антителами (goat anti mouse/rabbit, Dako), меченными иероксидазой, во влажной камере в течение 30 мин. при 37°С. 6. Промывание буфером Dako (3 раза по 5 мин.). 7. Визуализация продуктов реакции на срезах 3,3-днамидобетиднном, как субстратом для нерокендазы, в течение 1-10 мин. 8. Промывание фосфатным буфером для остановки реакции. |