|
Глава 5. Материалы, и методы исследования 5.1 Характеристика антигенов В качестве антигена мы использовали препараты коллагена I и II типов производства фирмы «ICN» (каталоговый номер № С-9879, из кожи телёнка (Calf Skin) для первого типа и № С-8886 из бычьего# ахиллового сухожилия (Bovine Achilles Tendon) для второго). Чистота препарата составляла 95% (по данным производителя). 5.2. Иммунологические методы < Антитела к коллагену I и II типов определялись непрямым твердофазным иммуноферментным методом на полистироловых планшетах (ELISA-тест) по классической методике, описанной ранее в ряде источников литературы (29, 102, 242, 329, 338) с изменения« ми. Выбор ИФА в качестве основного метода, применяющегося в 9 нашей работе, основан на тех фактах, что ИФА удобен и. относительно прост в выполнении, отличается высокой специфичностью и чувствительностью. Планшеты (DYNATECH, Германия) сенсибилизировали коллагеном I и II типа компании ICN (Cat. № С-9879 и С-8886 соответственно) растворенным в фосфатном буфере pH 0,1 М pH 7,2 в концентрации 20 мкг/мл (15 мкг/мл для коллагена II типа) по 150 мкл в каждой лунке. Инкубировали 18 часов при температуре 4°С. После $ отмывки от несвязавшегося антигена 4 раза по 3 минуты забуференным физиологическим раствором (рН=7,2) с добавлением 0,05% Твина-20 в лунки вносили по 150 мкл 2% бычьего сывороточного альбумина в ЗФР для предотвращения неспецифического связывания белка с полистироловой поверхностью. После 1 часа инкубации при 37°С планшеты повторно промывали ЗФРТ и вносили по 100 |
Глава 4. Материалы и методы исследования 4 1 Характеристика антигенов В качестве антигена мы использовали препарат Lглутаматдекарбоксилазы (ЕС 4 1 1.15) производства фирмы «ICN», каталоговый номер N157218, из Esherichia coll. Препарат представляет собой суспензию фермента с активностью 100 Ед в 4,2 М сульфате аммония, содержащем 0,1 тМ пиридоксальфосфата в качестве стабилизатора. Активность фермента составляла 25 ЕД/мг белка (биуретовый метод). Таким образом, один флакон содержал 4 мг чистого фермента. 1 ЕД энзима декарбоксилировала 1 мкмоль С02 от L-глутаминовой кислоты в минуту при pH 5,0 при 37°С. 4 2 Иммунологические методы. Антитела к глутаматдекарбоксилазе определялись непрямым твердофазным иммуноферментным методом на полистироловых планшетах (ELISA-тест) по классической методике, описанной ранее в ряде источников литературы (94,118,146) с изменениями Выбор ИФА в качестве основного метода, применяющегося в нашей работе, основан на тех фактах, что ИФА удобен и относительно прост в выполнении, отличается высокой специфичностью и чувствительностью. Планшет (DYNATECH, Германия) сенсибилизировали глутаматдекарбоксилазой в концентрации 10 мкг/мл. Суспензию препарата доводили до нужной концентрации в КББ рН=9,6 и вносили по 150 мкл в каждую лунку планшета. Инкубировали 18 часов при температуре 4°С. После отмывки от несвязавшегося антигена 4 раза по 3 минуты забуференным физиологическим раствором (рН=7,2) с добавлением 0,05% Твина-20 в лунки вносили по 150 мкл 2% бычьего сывороточного альбумина в забуференном физиологическом растворе для предотвращения неспецифического связывания белка с полистироловой поверхностью После 1 часа инкубации при 37°С планшеты повторно промывали забуференным физиологическим раствором с добавлением 0,05% Твина-20 и вносили по 100 мкл исследуемых сывороток, разведенных 1% бычьим сывороточным альбумином до концентрации 1:100 Через 1 час инкубации при 37°С и отмывки 4 раза по 3 минуты в каждый планшет вносили афинно очищенные антитела против иммуноглобулинов человека, меченые пероксидазой, в рабочем разведении Т 1000, указанном фирмой-изготовителем (Sigma,США) После инкубации (1 час при 37°С) и отмывки (4 раза по 3 минуты) в лунки вносили по 100 мкл субстрата раствора ортофенилендиамина в фосфат-цитратном буфере (рН=4,9) с добавлением 0,02 мл 3% раствора перекиси водорода Реакцию останавливали через 30 минут 1N раствором серной кислоты Учет результатов проводился на спектрофотометре с вертикальным лучом MULTISCAN-EX (Labsystems, Финляндия), при длине волны 490 нм В данной работе проводилось определение антинуклеарного фактора по Кунсу методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием в качестве субстрата криостатных срезов печени крысы (20), концентрации циркулирующих иммунных комплексов методом преципитации с полиэтиленгликолем 6000 по Haskova в модификации Б А Лемперта (41). |