|
надосадочного слоя и смешивали с 1,2 мл дистиллированной воды. Замер проводили на фиолетовом фильтре, длина волны 440 нм. Об активности фермента судили по степени ингибирования процесса восстановления нитросинего тетразолия супероксидными радикалами, генерируемыми системой рибофлавин-тетраметилендиамин в присутствии эритроцитов. Активность выражали в процентах торможения. Активность каталазы определяли по методу М.А. Королюк и сотр., 1988 [52]. К 0,1 мл отмытых эритроцитов приливали 9,9 мл 5 мМ фосфатного буфера (pH 7,0) на 1% тритоне х-100. Выдерживали в холодильнике 15 минут, затем в кювету спектрофотометра (СФ-46) помещали 2,7 мл 50 мМ фосфатного буфера (pH 7,0) 0,3 мл 60 мМ свежеприготовленной перекиси водорода и 0,1 мл взвеси эритроцитов с тритоном х-100. Измеряли снижение оптической плотности в течение 3-х минут при длине волны 240 нм, фильтр фиолетовый. Высчитывали изменение оптической плотности за 1 минуту по формуле: Е минут х 32,7. Активность выражали в мМ/мин/мл. Для оценки переносимости лечения были использованы три градации: 1. Отличная переносимость отсутствие побочных эффектов в течение всего периода исследования. 2. Хорошая переносимость преходящие побочные эффекты, не требующие отмены препарата. 3. Неудовлетворительная переносимость наличие побочных эффектов, требующих отмены препарата. |
1. Отличная переносимость отсутствие побочных эффектов в течение всего периода исследования. 2. Хорошая переносимость преходящие побочные эффекты, не требующие отмены препарата. 3. Неудовлетворительная переносимость наличие побочных эффектов, требующих отмены препарата. 2.3 С пециальны е биохимические м етоды исследования. 1. Выделение эритроцитов Кровь для исследования забиралась из локтевых вей путем венепункции. Забор крови проводили натощак. В качестве аитикоагулягита применяли гепарин из расчета 300-500 M E на 1 мл крови. Кровь центрифугировали в течении 10 минут со скоростью 3000 об/мин.. затем убиралась сыворотка. Полученный материал использовали для дальнейшего исследования. 2. Приготовление липидных экстрактов из взвеси эритроцитов. В чистую пробирку помещали 0,2 мл эритроцитариой взвеси и добавляли 4 мл спирто-эфирной смеси в соотношении 3:1. Содержимое пробирки нагревалось на водяной бане до кипения, а затем отфильтровывалось в чистую пробирку, в первую пробирку снова добавляли 4 мл спирто-эфирной смеси и фильтровали, объединяя с первым фильтратом. Полученный экстракт выпаривали на водяной бане досуха. Сухие липидные экстракты использовались далее для определения продуктов псрекисного окисления липидов (ПОЛ) диеновых конъюгатов (ДК), оснований Ш иффа (Ш О), малонового диальдегида (МДА) в мембранах эритроцитов. 3. Определение содержания продуктов ПОЛ в мембранах эритроцитов. Диеновые конъюгаты (ДК) 57 Об активности фермента судили по степени ингибирования процесса восстановления нитросинего тетразолия в фотохимической системе: рибофлавии-свет-N, N, N, N-тетрамителендиамин-кислород в присутствии эритроцитов. Активность выражали в процентах торможения. Определение активности каталазы (Кат) Активность каталазы определяли по методу М.А. Королюк и сотр., 1988 [45]. К 0,1 мл отмытых эритроцитов приливали 9,9 мл 5 мМ фосфатного буфера (pH 7,0) на 1% тритоне х-100. Выдерживали в холодильнике 15 минут, затем в кювету спектрофотометра (СФ-46) помещали 2,7 мл 50 мМ фосфатного буфера (pH 7,0) 0,3 мл 60 мМ свежеприготовленной перекиси водорода и 0,1 мл взвеси эритроцитов с тритоном х-100. Измеряли снижение оптической плотности в течение 3-х минут при длине волны 240 нм, фильтр фиолетовый. Высчитывали изменение оптической плотности за 1 минуту по формуле: Е минут х 32,7. Активность выражали в мМ/мин/мл. 2.4 Исследование деформируемости эритроцитов Способность эритроцитов к деформации оценивали с помощью метода эктацитометрии. Кровь для исследования забиралась с помощью венопункции из вены правого плеча в одноразовый шприц объемом 2 мл и стабилизировалась 0,3 % раствором цитрата натрия. Проба крови в объеме 100 мкл помещалась в 3 мл 20 % раствора полисахарида Ficoll-400, растворенного в фосфатном буфере (0,3 М NaCl, 0,02 М Na2HP0 4 , 0,005 М КН2РО4, pH = 7,4, при температуре 37°С). Размешивание эритроцитов в растворе Ficoll-400 проводили в фарфоровой чашке до появления однородно окрашенного раствора без включений и клеточных агрегатов. Деформируемость эритроцитов определяли на устройстве для оценки деформабилыюсти эритроцитов'. 59 ‘ патент РФ № 2236009 |