|
аминокислотной последовательности для ГП из эритроцитов быка и по комплементарной ДНК для ГП из эритроцитов мыши. Первая (молекулярная масса 21,2 тыс. дальтон) состоит из 198, вторая из 201 аминокислотных остатка. Последовательности совпадают на 86 %. Высока идентичность и с ГП из печени крысы, для которой первичная структура установлена частично. В структуре ГП есть все 20 аминокислот, на Nконце находится полностью гидрофобных нонапептид [54]. Селеноцистеин это 45-й остаток в ГП быка (47-й в ГП мыши). Рентгеноструктурный анализ с разрешением 0,20 нм кристаллов ГП из эритроцитов быка показал, что ГП представляет собой ригидный энзим, состоящий из двух димеров, образующий планарный тетрамер симметрией 222. На его верхней и нижней поверхностях находятся по два атома селена. Каждая субъединица имеет почти сферическую форму с диаметром 3,8 нм. Ее центральная часть представлена четырьмя (3-структурами в окружении двух а спиралей а! и а4; в области контакта субъединиц имеются еще спирали Центральная фиксирована элементами вторичной структуры. Атом селена расположен у N-конца dl спирали, фиксированной между pi 02 структурами. При рассмотрении третичной структуры он находится на поверхности гидрофобного плоского углубления, окруженного четырьмя положительно заряженными остатками аргинина (50-м, 96-м, 177-м и 178-м) [148]. Основным в катализе является селеноцистеин, который переходит из селенольной (восстановленной) формы ESeH, точнее ее активной формы — селенолатного иона ESe' , в окисленную селениновую форму ESeOH, а затем в смешанный селеносульфид (или селенодисульфид) с глутатионом ESeSG и наконец, снова в ESe' [148,192,248]. При этом на первом этапе атом Se в ESe" даст электрон для нуклеофильной атаки электрофильного атома О в ROOH, а на втором этапе тиолатный анион GS' атакует электрофильный атом Se в ESeOH. Третий этап аналогичен типичной реакции тиол-дисульфидного обмена. Очевидно, что окисленный и |
Каждая из субъединиц ГП состоит из 178—201 аминокислотных остатков [125]. Полная первичная структура установлена по аминокислотной последовательности для ГП из эритроцитов быка и по комплементарной ДНК для ГП из эритробластов мыши. Первая (молекулярная масса 21,2 000 а.е.м.) состоит из 198, вторая из 2 0 1 аминокислотного остатка; полные совпадения равны 8 6 %. Высока гомология и с ГП из печени крысы, для которой первичная структура установлена частично. В структуре ГП имеются все 20 аминокислот; на N-конце находится полностью гидрофобный нонапептид [47]. Рентгеноструктурный анализ с разрешением 0,20 нм кристаллов ГП из эритроцитов быка показал, что этот довольно ригидный энзим состоит из двух димеров, образующих почти планарный тетрамер с симметрией 222. На его верхней и нижней поверхностях расположено по два атома селена (Se). Каждая субъединица имеет почти сферическую форму с диаметром 3,8 нм. Её центральная часть состоит из четырёх P-структур в окружении двух d-спиралей dj и 6 4 . В области контакта субъединиц имеются ещё две d-спирали а2 и аз. Центральная часть молекулы (63%) ригидно фиксирована хорошо эуктуры: 24% d-спиралей, 12% рструктур и 27% P-изгибов. Атом Se расположен у N-конца di-спирали, фиксированной между рг р2-структурами. В трёхмерной структуре он находится на поверхности гидрофобного плоского углубления, окруженного четырьмя положительно заряженными остатками аргинина (50-м, 96-м, 177-м, 178-м) [125]. Ключевую роль в катализе играет селеноцистеин (45-й остаток в ГП быка 47-й в ГП мыши), который последовательно переходит из восстановленной селенольной формы ESeH, точнее её активной формы селенолатного иона ESe\ в окисленную селениновую форму ESeOH, а затем в смешанный селеносульфид (или селенодисульфид) с глутатионом ESeSG и, наконец, снова в ESe [125,178,237]. При этом на первом этапе атом Se в ESe' даёт электрон для нуклеофильной атаки электрофильного атома О в ROOH, а на втором этапе тиолантный анион GS* атакует электрофильный атом Se в ESeOH. Третий этап аналогичен типичной реакции тиол-дисульфидного обмена. Очевидно, что окисленный и восстановленный субстраты в активном центре ГП не встречаются, а связываются этим центром последовательно [178]. Рассмотрим более детально три этапа глутатионпероксидазной реакции. На первом этапе в ней участвует ESe\ так как селенол в отличие от тиолов почти полностью диссоциирует при физиологическом значении pH и высоко реактивен по отношению к гидропероксидам. Между последними и ГП происходит неспецифическая биомолекулярная реакция, которая опосредуется скорее переходным состоянием, чем фермент-субстратным комплексом ввиду отсутствия какой-либо структурной дифференциации активного центра. Гидропероксид лишь эффективно соударяется с селенолатом, а его гидрофобная часть (в случае ROOH) в это время «планирует» над поверхностью. В пользу этого свидетельствуют также очень широкая специфичность ГП по отношению к ROOH и неопределенная максимальная скорость реакции Умах [125]. На втором этапе реакции GSFI в низкоэнергетической вытянутой Y-конформации связывается ферментом в результате электростатического взаимодействия глицинового карбоксила с Арг50 и d-глутаматного карбоксила с Арг177, при этом гуанидиновые группы аргининов движутся, вероятно, навстречу GSH. Однако конформационные изменения ГП при этом невелики. Этот слабый комплекс, вследствие немедленной внутримолекулярной перестройки, образует устойчивую форму ESeSG. Третий этап регенерация исходного остояния фермента в результате реакции предыдущей формы со второй молекулой GSH [125,178]. Специфичность ГП к донорному восстановленному субстрату ниже, чем у большинства глутатионзависимых ферментов [125,178]. Однако единственным реальным тиольным субстратом является GSH ввиду его резкого преобладания (90-95%) в клетке [116]. Специфичность к акцепторному окисленному субстрату чрезвычайно широка. ГП восстанавливает Н2 О2 и почти |