Второй уровень —аллостерическая регуляция. Аллостерическими ингибиторами служат КоА (концентрация полуингибирования равна 60 мкМ), а также нуклеотиды, особенно НАДФ-Н, а затем НАДФ+ и АТФ, которые могут действовать в физиологических условиях. Показана избирательная десентизация ГП к АТФ, что доказывает аллостерическую природу ингибирования АТФ. Третий уровень —регуляция гормонами краткосрочного действия и вторыми посредниками. Стресс и экзогенные катехоламины активируют ГП во многих тканях и у многих видов млекопитающих по цепи: (3-адренорецепторы аденилатциклаза цАМФ протеинкиназа А. Четвертый уровень регуляция экспрессии Считается, что ГП — не конститутивный, а индуцибельный фермент. Особенно резко его экспрессию стимулирует селен, а недостаток последнего ингибирует ГП [54,148]. Индуцируют ГП и женские половые гормоны. Активность фермента в клетках печени и эритроцитах крысы выше у самок, чем у самцов. Экспериментально показано, что кастрация самцов увеличивает активность ГП в печени, а самок — наоборот, снижает. Значительно увеличивают активность ГП прогестерон и эстрадиол [54,148]. ГП определяют двумя основными путями: 1 По уменьшению восстановленного глутатиона полярографически или химически; 2. По уменьшению НАДФ-Н в сопряженном ферментном тесте с добавлением глутатионредуктазы и НАДФ-Н. Имеется достаточно много методик определения активности ГП в биологическом материале. Из них наибольшей популярностью пользуются спектрофотометрические, основанные на измерении скорости окисления НАДФН в сопряженной глутатионредуктазной реакции или по скорости окисления восстановленной формы глутатиона [117]. Меньше [199],применяются колориметрические [199], флюориметрические радиоиммунные [124] методы. Первые из них не отличаются высокой |
колебаниям при различных физиологических и патологических состояниях и зависит от пола, характера питания, сезона и прочих условии [47,193,208,155].По большинству данных активность ГП наиболее высока в печени, надпочечниках, хрусталике, эритроцитах поджелудочной железе, затем следуют почки; средние значения характерны для сердца, легких, ЖКТ, островков поджелудочной железы, мышц. ГП есть во всех структурах соединительной ткани, особенно в матриксе. В большинстве тканей ГП преобладает или является практически единственным пероксидазным ферментом [124,125,237,17,201,120]. В клетке ГП локализуется преимущественно в цитозоле и матриксе митохондрий. На цитозоль клеток печени приходится 6 6 75% общей активности, на митохондрии ГП присутствует в ядрах ( 23 —30%. Другие органеллы изучены хуже, но 1 0 % ); ее очень мало в микросомах и (вплоть фермента, обнаружены формы, связанные в печени и почках с плазматической мембраной [124,125,237,51]. Выделяют четыре уровня регуляции ГП. Первый уровень —субстратная регуляция. Сопоставление концентрации субстратов с кинетическими константами ГП видетельствует, что фермент относительно насыщен GSH, но в большинстве тканей не насыщен промежуточное положение занимают ROOH (судя по плазме крови). Следовательно, реальная активность ГП должна быть намного меньше максимальной и лимитироваться количеством возникающей (возможно 7?ООТ/).Другим лимитирующим фактором может быть НАДФ-Н ввиду сопряжения работы ГП и глутатионредуктазы. Второй уровень аллостерическая регуляция. Аллостерическими ингибиторами служат КоА (концентрация полуингибирования равна 60 мкМ), а таюке нуклеотиды, особенно НАДФ+ и АТФ, которые могут действовать в физиологических условиях. Показана избирательная десентизация ГП к АТФ, что доказывает аллостерическую природу ингибирования АТФ. Третий уровень —регуляция гормонами краткосрочного действия и вторыми посредниками. Стресс и экзогенные катехоламины активируют ГП во многих тканях иу многих видов млекопитающих по цепи: p-адренорецепторы —>аденилатциклаза —>цАМФ —> протеинкиназа А. Четвертый уровень регуляция экспрессии. Считается, что ГП не констуитивный, а индуцибельный фермент. Особенно резко его экспрессию стимулирует селен, а недостаток последнего ингибирует ГП [125,47]. Индуцируют ГП и женские половые гормоны. Активность фермента в клетках печени и эритроцитах крысы выше у самок, чем у самцов. Экспериментально показано, что кастрация самцов увеличивает активность ГП в печени, а самок —наоборот, снижает. Значительно увеличивают активность ГП прогестерон и эстрадиол [125,47]. ГП открыта в 1957 г. В 1968 г. показано, что она восстанавливает органические гидроперекиси. В 1973 г. установлено, что ГП —селенопротеид [124,125]. В 1976 г. обнаружена «неселеновая ГП», оказавшаяся глутатионтрансферазой. К 1983-1984 гг. выяснены полная первичная структура ГП и её третичная структура. В 1986 г. выделены и расшифрованы специфическая мРНК и ген ГП, установлен триплет, кодирующий селеноцистеин. Регуляция ГП аллостерическими эффекторами обнаружена в 1970 г., индукция эстрогенами в 1969 г., активация катехоламинами и цАМФ в 1985 г. [47]. ГП катализирует реакции: 2GSH + Н20 2-+ GSSG + 2Н20 2GSH + ROOH -* GSSG +ROH + Н20 В этих реакциях GSH (восстановленный глутатион) восстанавливает Н20 2 или органические гидроперекиси (ROOH) соответственно до воды или гидроксипроизводного и в результате переходит в окисленную дисульфидную форму GSSG [47]. Имеется достаточно много методик определения активности ГП в биологическом материале. Из них наибольшей популярностью пользуются спектрофотометрические, основанные на измерении скорости окисления НАДФН в сопряженной глутатионредуктазной реакции или по скорости окисления восстановленной формы глутатиона [99]. Меньше применяются колориметрические [185], флюориметрические [185], радиоиммунные [108] методы. Первые из них не отличаются высокой точностью и воспроизводимостью, а другие требуют достаточно сложной и дорогостоящей аппаратуры и реактивов. Для разделения изоэнзимов ГП используются электрофоретические и хроматографические методы [163]. ГП выделена и очищена до гомогенности из 15 источников семи тканей семи видов млекопитающих и двух видов рыб. Удельная активность особенно высока в препаратах ГП из эритроцитов быка (550—790 мкмоль/мин на I мг белка), а наиболее низка в препаратах из аорты свиньи и плазмы крови человека (20-28 мкмоль/мин на 1мг белка) [125]. Исследование гомогенных препаратов показало, что —ГП гомотетрамер с молекулярной массой 74 000— 105 000 а.е.м., масса субъединиц 18 000—25 000 а.е.м. [124,237]. В эритроцитах человека обнаружены две изоформы ГП, существенно отличающиеся по физико-химическим свойствам от ГП плазмы. При гель-фильтрации в плазме обнаруживаются 2 изоформы ГП (А и В), которые при проведении ионно-обменной хроматографии разделяются ещё на подфракции А1 и А2, В1 и В2. Изоэнзим А представляет собой тетрамер, а В — мономер. Изоформа А более термостабильна, чем изоэнзим В [47,120,226]. Глутатионпероксидазная активность — результат кооперации 2 изоэнзимов — селензависимой и селеннезависимой ГП. Селензависимые и селеннезависимые формы ГП существенно различаются по каталитическим свойствам: первые активно метаболизируют перекиси водорода, органические гидроперекиси, а вторые — обладают субстратной специфичностью к гидроперекисям, но не реагируют с перекисью водорода. |