|
точностью и воспроизводимостью, а другие требуют достаточно сложной и дорогостоящей аппаратуры и реактивов. Для разделения изоэнзимов ГП используются электрофоретические и хроматографические методы [179]. Обезвреживание Н20 2. В восстановлении Н20 2 участвуют ГП и каталаза. Есть мнение о комплементарности двух ферменто их равном вкладе в обезвреживание Н20 2. В пользу этого может свидетельствовать отсутствие одного из ферментов в некоторых объектах: ГП —в печени морской свинки и у беспозвоночных [148], а каталазы в эритроцитах утки (и малая активность у голубя и цыпленка) [72]. Более того, в эритроцитах утки повышены активность ГП и концентрация GSH [72], а у некоторых насекомых, лишенных ГП, чрезвычайно высока активность СОД и каталазы. Однако взаимозаменяемость ферментов — исключение, а не правило. Введение в организм сильного и специфического ингибитора каталазы 3-амино-1,2,4-триазола не повышает активность ГП, а дефицит Se, даже снижающий активность ГП печени в 65 раз, не увеличивает активность каталазы. Очевидно, ферменты функционируют независимо друг от друга [54]. Роль ГП в детоксикации перекиси водорода значительна. Вопервых, ГП функционирует в таких важных компартментах клетки, как гиалоплазма, митохондрии и ядерные структуры. ГП цитоплазмы обеспечивает метаболизм Н20 2, возникающей в микросомах, а частично и в пероксисомах. В отличие от этого, каталаза восстанавливает Н20 2 только из пероксисом [147,248]. Во-вторых, намного большее сродство 6 зГП к н2 о2 (Км ГПО ~10м, а каталазы 10М [147] или даже 1 М [72]) определяет ее ведущую роль в метаболизме более низких, физиологических, концентраций Н20 2 и, вероятно, концентраций, на один два порядка более высоких. В-третьих, в некоторых тканях каталаза почти отсутствует (сердце) или ее активность минимальна (головной мозг, легкие), а активность ГП достаточно высока [54]. Вчетвертых, в эритроцитах дефицит ГП легче, чем дефицит каталазы, |
Имеется достаточно много методик определения активности ГП в биологическом материале. Из них наибольшей популярностью пользуются спектрофотометрические, основанные на измерении скорости окисления НАДФН в сопряженной глутатионредуктазной реакции или по скорости окисления восстановленной формы глутатиона [99]. Меньше применяются колориметрические [185], флюориметрические [185], радиоиммунные [108] методы. Первые из них не отличаются высокой точностью и воспроизводимостью, а другие требуют достаточно сложной и дорогостоящей аппаратуры и реактивов. Для разделения изоэнзимов ГП используются электрофоретические и хроматографические методы [163]. ГП выделена и очищена до гомогенности из 15 источников семи тканей семи видов млекопитающих и двух видов рыб. Удельная активность особенно высока в препаратах ГП из эритроцитов быка (550—790 мкмоль/мин на I мг белка), а наиболее низка в препаратах из аорты свиньи и плазмы крови человека (20-28 мкмоль/мин на 1мг белка) [125]. Исследование гомогенных препаратов показало, что —ГП гомотетрамер с молекулярной массой 74 000— 105 000 а.е.м., масса субъединиц 18 000—25 000 а.е.м. [124,237]. В эритроцитах человека обнаружены две изоформы ГП, существенно отличающиеся по физико-химическим свойствам от ГП плазмы. При гель-фильтрации в плазме обнаруживаются 2 изоформы ГП (А и В), которые при проведении ионно-обменной хроматографии разделяются ещё на подфракции А1 и А2, В1 и В2. Изоэнзим А представляет собой тетрамер, а В — мономер. Изоформа А более термостабильна, чем изоэнзим В [47,120,226]. Глутатионпероксидазная активность — результат кооперации 2 изоэнзимов — селензависимой и селеннезависимой ГП. Селензависимые и селеннезависимые формы ГП существенно различаются по каталитическим свойствам: первые активно метаболизируют перекиси водорода, органические гидроперекиси, а вторые — обладают субстратной специфичностью к гидроперекисям, но не реагируют с перекисью водорода. Роль ГП в организме. В аэробных клетках всегда образуются реактивные метаболиты О2 (О2 '-, Н20 , Н О ) в доле, соответствующей ~5% поглощенного О2 , при этом наиболее активный радикал НО' возникает в основном из Н2 О2 [51]. Эти метаболиты вызывают образование органических пероксидов ROOH, прежде всего липидов и ДНК. Затем образуются вторичные токсичные продукты, повреждающие мембраны, ДНК, белки и клетку в целом [51,7]. Так как за сутки человек вдыхает 430 л, или 19,3 моль О2 , то 1 моль О? (5%) переходит в реактивные метаболиты. При отсутствии их метаболизма это привело бы к средней концентрации 14 мМ, что в 1 0 6 раз превышает реальную концентрацию Н2 О2 в большинстве тканей, равную 10М. Следовательно, происходит чрезвычайно мощный метаболизм этих веществ [47]. Выделяют четыре линии ферментной защиты от реактивных метаболитов CV. 1) супероксиддисмутазу, 2) ГП и каталазу, 3) ГП и глутатионтрансферазу, 4) глутатионтрансферазу, а также формальдегиддегидрогеназу, глиоксалазу, хинонредуктазу (ДТ-диафоразу) и эпоксидгидратазу [237]. Обезврелсивание Н2 О2 . Восстановление Н2 О2 (реакция 1) осуществляют ГП и каталаза. Высказано мнение о комплементарности двух ферментов и их равном вкладе в обезвреживание Н2Ог. В пользу этого может свидетельствовать отсутствие одного из ферментов в некоторых объектах: ГП в печени морской свинки и у беспозвоночных [125], а каталазы — в эритроцитах утки (и малая активность у голубя и цыпленка) [60]. Более того, в эритроцитах утки повышены активность ГП и концентрация GSH [60], а у некоторых насекомых, лишенных ГП, чрезвычайно высока активность СОД и каталазы. Однако взаимозаменяемость ферментов — исключение, а не правило. Введение в организм сильного и специфического ингибитора каталазы —3-амино-1,2,4-триазола не повышает активность ГП, а дефицит Se, даже снижающий активность ГП печени в 65 раз, не увеличивает активность каталазы. Очевидно, ферменты функционируют независимо друг от друга [47]. В целом же роль ГП в обезвреживании Н2 О2 значительно больше, что аргументируется рядом фактов. Во-первых, ГП функционирует в таких важных компартментах клетки, как гиалоплазма, митохондрии и ядерные структуры. ГП цитоплазмы обеспечивает метаболизм Н2 О2 , возникающей в микросомах, а частично и в пероксисомах, после ее диффузии в гиалоплазму. В отличие от этого, каталаза восстанавливает Н2 О2 только из пероксисом [237,124,51]. Во-вторых, намного большее сродство ГП к Н2 О2 6 (Км ГПО -10-° М, а каталазы 103 М [124] или даже 1 М [60]) определяет ее ведущую роль в метаболизме более низких, физиологических, концентраций Н2 О2 и, вероятно, концентраций, на один два порядка более высоких. В-третьих, в некоторых тканях каталаза почти отсутствует (сердце) или ее активность минимальна (головной мозг, легкие), а активность ГП достаточно высока [47]. В-четвертых, в эритроцитах дефицит ГП легче, чем дефицит каталазы, приводит к гемолизу: при недостаточности ГП любой вариант пероксидного стресса опасен, а при наследственной акаталаземии (генетический дефект у человека, в норме у уток) гемолиз возникает только после более чем 90%-ного окисления фонда GSH в эритроцитах [125,124], т.е. фактически при возникновении функциональной недостаточности ГП. Последняя защищает эритроцит от образования метгемоглобина, преждевременного старения или гемолиза [125,124]. В-пятых, в хрусталике глаза Н2 О2 метаболизируется больше ГП, чем каталазой [124]. При развитии катаракты параллельно резкому накоплению Н2 О2 существенно снижается активность ГП, данные же об изменениях активности каталазы неоднозначны [125]. В-шестых, ГП лучше, чем каталаза, защищает эпителиальные клетки легкого, клетки эндотелия и опухолей от экзогенной Н2 О2 и Н2 О2 , генерированной сегментоядерными нейтрофилами и макрофагами [37]. Ингибиторы каталазы не изменяют устойчивость |