|
3.2.3. Определение антител к глутатионпероксидазе иммуноферментным методом с использованием иммобилизированных гранулированных антигенных препаратов с магнитными свойствами Антитела к ГП определяли методом непрямого иммуноферментного анализа, основанного на использовании меченных ферментом специфических иммуноглобулиновых препаратов, позволяющих по интенсивности окраски субстрата судить о количестве антител в сыворотке. Анализ проводился в полистироловых планшетах Immulon 2 (Dynatech Labs, Германия). Неспецифическое связывание блокировали инкубацией 1% раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) на карбонат-бикарбонатном буферном растворе с рН=9,6. Следующим этапом в лунки планшета вносили по 10 мкл 10% взвеси ИГАП, выполняющего роль специфического антигена. Исследуемую сыворотку разводили 1:200 в 0,01М фосфатном буферном растворе с рН=7,4, содержавшим 1% БСА и вносили в дубликатах по 200 мкл в лунки микротитрационного планшета, параллельно ставили контроль на субстрат и конъюгат. Планшеты инкубировали в течение 120±2 мин в термостате при 37±1°С на магнитной мешалке, после чего выполняли трехкратную отмывку ЗФР с 0,05% Твин20. Связавшиеся антитела выявляли с помощью моноклональных диагностических антител против иммуноглобулинов человека, конъюгированных со щелочной фосфатазой производства ЗАО «Биосан» (Новосибирск, Россия). Данные антитела использовали в рабочем разведении 1:5000, которое определяли в предварительных опытах, и вносили по 100 мкл в каждую лунку. После 60-минутной инкубации содержимое лунок удаляли и трехкратно промывали ЗФР с 0,05% Твин-20 в течение 3 минут. В качестве хромогена использовали раствор нитрофенилового-пара эфира фосфорной кислоты динатриевой соли (ч.д.а., Германия) в |
3.2.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИТЕЛ К ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЕ ИММУНОФЕРМЕНТНЫМ МЕТОДОМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММОБИЛИЗИРОВАННЫХ ГРАНУЛИРОВАННЫХ АНТИГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ С МАГНИТНЫМИ СВОЙСТВАМИ Иммуноферментный анализ основан на использовании специфических иммуноглобулиновых препаратов, меченных ферментом, позволяющих по интенсивности окраски субстрата судить о количестве антител в сыворотке больных. Анализ проводился в полистироловых планшетах Immulon 2 (Dynatech Labs, Германия). Неспецифическое связывание блокировали инкубацией 1% раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) на карбонатбикарбонатном буферном растворе с рН=9,6. Затем в лунки планшета вносили по 10 мкл 10% взвеси ИГАП, выполняющего роль специфического антигена. Исследуемая сыворотка разводилась 1:200 в 0,01М фосфатном буферном растворе с рН=7,4, содержавшим 1% БСА и вносилась в дубликатах по 200 мкл в лунки микротитрационного планшета, параллельно ставили контроль на субстрат и конъюгат. Планшеты инкубировалась в течение 120±2 мин в термостате при 37 ± 1°С на магнитной мешалке, после чего выполнялась трехкратная отмывка ЗФР с 0,05% Твин-20. Связавшиеся антитела выявляли с помощью моноклональных диагностических антител против иммуноглобулинов человека, конъюгированных со щелочной фосфатазой производства ЗАО « Биосан » (Новосибирск, Россия). Данные антитела использовали в рабочем разведении 1:5000, которое определяли в предварительных опытах, и вносили по 100 мкл в каждую лунку. Проведя инкубацию в течение 60 минут, содержимое лунок удаляли и промывали 3 раза по 3 минуты ЗФР с 0,05% Твин-20. В качестве хромогена использовался раствор нитрофенилового-пара эфира фосфорной кислоты динатриевой соли (ч.д.а., Германия) в концентрации 1 мг/мл в субстратном буфере (1М диэтаноламин, 0,5 мМ MgCL, рН=9,8), |