|
2.2 Цитохимические методы исследования нейтрофильных лейкоцитов 2.2.1 Цитохимический метод выявления катионного белка Для цитохимического выявления катионного белка в лейкоцитах используют диахромовые анионные красители. В основе этих методов лежит избирательное прочным зеленым илиреагирование катионного белка красителями бромфеноловым синим при pH 8,1-8,2. При этом катионный белок является единственным биополимером, взаимодействующим с анионовым красителем с образованием ионных связей (Б.С. Нагоев, 1982). Оригинальный метод выявления катионного белка нейтрофильных лейкоцитов периферической крови экспериментальных животных и человека с использованием доступного отечественного препарата-красителя бромфенолового синего при pH 8,2 был предложен М.Г. Шубичем (1974). Для цитохимического исследования содержания катионного белка в лейкоцитах мы использовали методику М.Г. Шубича (1974) в прописи Б.С. Нагоева (1983). Методика проведения реакции. 1. Мазки крови готовят по обычным правилам на очищенных и обезжиренных предметных стеклах и высушивают на воздухе. 2. Свежеприготовленные мазки фиксируют 4%-ным формалино-спиртовым раствором в течение 1минуты. 3. Тщательно промывают дистиллированной водой и высушивают. 4. Окрашивают в 0,1%-ном растворе бромфенолового синего в 0,05 М боратном буфере (pH 8,2) в течение 1-2 минут. 5. Мазки промывают в трех сменах 0,05 М борагного буфера по 1-2 минуте в каждой смене. 6. Высушивают и докрашивают ядра в 1%-ном растворе сафранина 30-60секунд. 7. Мазки тщательно промывают проточной водопроводной водой. 8. Высушивают и микроскопируют под иммерсионным объективом. Результат: гранулы нейтрофильных лейкоцитов интенсивно окрашиваются в синии цвет, а ядро и цитоплазма не окрашиваются. |
Методика проведенияреакции. 1. Мазки крови готовят по обычным правилам на очищенных и обезжиренных предметных стеклах и высушивают на воздухе. 2. свежеприготовленные мазки фиксируют 4%-ным формалино-спиртовым раствором-в течение 1-минуты_ _ _______________________ 3. тщательно промывают дистиллированной водой и высушивают. 4. Помещают в 0,5%-ный раствор сульфата меди на 1минуту. 5. Промывают в дистиллированной воде. 6. Помещают в инкубационную среду (миелопероксидазный реактив) на 2 минуты. 7. Промывают в дистиллированной воде. 8. Ядра докрашивают 0,02%-ным водным раствором сафранина в течение 1-2 минут. 9. Мазки споласкивают в проточной воде, высушивают и микроскопируют. Результат: миелопероксидаза содержится преимущественно гранулоцитов и выявляется в виде синих гранул. в цитоплазме Приготовление инкубационной среды 0,2 г бензидина растирают в ступке с небольшим количеством воды, добавляют 200 мл дистилированной воды при комнатной температуре. Фильтруют и прибавляют 4 капли (0,02 мл) 3%-ного раствора перекиси водорода. * 2.2.2 Определение активности щелочной фосфатазы в гранулоцитах Определение активности щелочной фосфатазы, так же, как и кислой, основаны на применении а-нафтилфосфата или его производных и различных диазотатов. На этом принципе основан вариант метода азосочетания, предложенный М.Г. Шубичем (1965).Реакция азосочетания для обнаружения щелочной фосфатазы основана на принципе одновременного захвата (Э.Пирс, 1962). Первичным продуктом реакции является нафтол, который освобождается в результате расщепления щелочной * фосфатазой а-нафтилфосфата, вводимого в инкубационную смесь в качестве субстрата действия фермента. Диазоний 4-амино-4-метоксидина (диазоль синий 0) немедленно вступает в реакцию азосочетания с а-нафтолом по мере того, как последний образуется в процессе ферментативной реакции азосочетания, выявляется встряхивают стакан до прекращения отхождения пузырьков газа. Затем инкубационные растворы сливают вместе. pH среды доводят с помощью 1 н едкого Ч натрия до 5,5. 2.2.4 Цитохимичесий метод выявления катионого белка Дляцитохимического выявления катионного белка влейкоцитах используют диахромовые анионные красители. В основе этих методов лежит избирательное реагирование катионного белка красителями прочным зеленым или бромфеноловым синим при pH 8,1-8,2. При этом катионный белок является единственным биополимером, взаимодействующим с анионовым красителем с образованием ионных связей (Б.С. Нагоев, 1982). Оригинальный метод выявления катионного белка нейтрофильных лейкоцитов периферической крови экспериментальных животных и человека с использованием доступного отечественного препарата-красителя бромфенолового синего при pH 8,2 был предложен М.Г. Шубичем (1974). Для цитохимического исследования содержания катионного белка в использовали методику М.Г. Шубича (1983). Методика проведения реакции. 1. Мазки коови готовят п предметных стеклах и высушивают на воздухе. 2. Свежеприготовленные мазки фиксируют 4%-ным формалино-спиртовым раствором в течение 1 минуты 3. Тщательно промывают дистиллированной водой и высушивают. 4. Окрашивают в 0,1%-ном растворе бромфенолового синего в 0,05 М боратном буфере (pH 8,2) в течение 1-2 минут. 5. Мазки промывают в трех сменах 0,05 М боратного буфера по 1-2 минуте в каждой смене. 6. Высушиваюти докрашивают ядра в 1%-ном растворе сафранина 30-60 секунд 7. Мазки тщательно промывают проточной водопроводной водой. 8. Высушивают и микроскопируют под иммерсионным объективом. Результат: гранулы нейтрофильных лейкоцитов интенсивно окрашиваются в сини] цвет, а ядро и цитоплазма не окрашиваются. 2.2.5 Цитохимический метод выявления гликогена Для выявления гликогена в лейкоцитах используется ШИК-реакция (реакция с Шифф-иодаткислотой). В результате взаимодействия реактива Шиффа (фуксинсернистой кислотой)_с диальдегидом, образуюшимся при^разрыве С-С связей в структурах, две смежные гликолевые группы в положении 1,2 (СНОН-СНОН) под влиянием перйодной кислоты окисляются и выпадает продукт реакции красного или фиолетового цвета (А.Л. Шабадаш, 1947). Цитохимическое определение содержания гликогена в лейкоцитах проводилось по методике А.Л. Шабадаша (1947). Методика проведения реакции 1. Мазки крови готовят по обычным правилам на очищенных и обезжиренных предметных стеклах и высушивают на воздухе. 2. Свежеприготовленные препараты фиксируют в абсолютном метиловом спирте в течение 5 минут. 3. Споласкивают в дистиллированной воде. 4. Помещают на 10 минут в 1%-ный раствор перйодной кислоты. 5. Промывают в дистиллированной воде и высушивают. 6. Помещают в реактив Шиффа на 30 минут при комнатной температуре в темноте. 7 Промывают мазки в трех сменах сернистой воды в течение 2-3 минут. 8. Промывают мазки в проточной воде в течение 10 минут. 9. Докрашивают ядра раствором гематоксилина Карацци. 10. Тщательно промывают мазки в проточной воде в течение 10-20 минут, высушивают и микроскопируют Результат: В нейтрофильных палочкои сегментоядерных лейкоцитах обнаруживают большое количество ШИК-положительных веществ, которые выявляются как диффузное окрашивание или скопление небольшого размера темновишневых гранул в цитоплазме клеток. Ядра лейкоцитов синие или темнофиолетовые. |