|
фосфатаза выявляется в виде диффузного окрашивания от светло-коричневого до темно-коричневого цвета. Возможно наличие зернистости аналогичной окраски. 2.2.5 Определение активности кислой фосфатазы лейкоцитов Современные методы цитохимического выявления активности фосфатаз, которые являются гидролитическими ферментами, основаны на применении анафтилфосфата натрия или его производных и различных диазотатов. Выявление кислой фосфатазы с помощью реакции азосочетания по Goldberg и Barka (1962) в модификации В.И. Дудецкого (1970) основано на принципе одномоментного захвата. Первичным продуктом реакции является нафтол, который освобождается в результате расщепления а-нафтилфосфата, вводимого в инкубационную среду в качестве субстрата действия фермента. В инкубационной среде применяется основной раствор трисдиазония розанилина, который немедленно вступает в реакцию азосочетания с а-нафтолом, по мере того, как последний образуется в процессе ферментативной реакции. Методика проведения реакции 1. Мазки крови готовят по обычным правилам на очищенных и обезжиренных предметных стеклах и высушивают на воздухе. 2. Фиксируют мазки крови в парах формалина в течение 1-2 минут. 3. Для удаления паров фиксатора выдерживают мазки на воздухе в течение 30 4 5 6 7 минут. Инкубируют мазки в течение 1,5 часов в инкубационной смеси, состоящей из равного количества инкубационных растворов 1 и 2. Инкубацию проводят в термостате при температуре +37С. Промывают мазки в проточной воде в течение 15 минут. Ополаскивают в дистиллированной воде. * Докрашивают ядра 0,25%-ным раствором «метиленового синего» в течение 30 секунд. 8. Споласкивают в проточной воде. 9. Мазки высушивают и микроскопируют. |
Методика проведенияреакции. 1. Мазки крови готовят по обычным правилам на очищенных и обезжиренных предметных стеклах и высушивают на воздухе. 2. свежеприготовленные мазки фиксируют 4%-ным формалино-спиртовым раствором-в течение 1-минуты_ _ _______________________ 3. тщательно промывают дистиллированной водой и высушивают. 4. Помещают в 0,5%-ный раствор сульфата меди на 1минуту. 5. Промывают в дистиллированной воде. 6. Помещают в инкубационную среду (миелопероксидазный реактив) на 2 минуты. 7. Промывают в дистиллированной воде. 8. Ядра докрашивают 0,02%-ным водным раствором сафранина в течение 1-2 минут. 9. Мазки споласкивают в проточной воде, высушивают и микроскопируют. Результат: миелопероксидаза содержится преимущественно гранулоцитов и выявляется в виде синих гранул. в цитоплазме Приготовление инкубационной среды 0,2 г бензидина растирают в ступке с небольшим количеством воды, добавляют 200 мл дистилированной воды при комнатной температуре. Фильтруют и прибавляют 4 капли (0,02 мл) 3%-ного раствора перекиси водорода. * 2.2.2 Определение активности щелочной фосфатазы в гранулоцитах Определение активности щелочной фосфатазы, так же, как и кислой, основаны на применении а-нафтилфосфата или его производных и различных диазотатов. На этом принципе основан вариант метода азосочетания, предложенный М.Г. Шубичем (1965).Реакция азосочетания для обнаружения щелочной фосфатазы основана на принципе одновременного захвата (Э.Пирс, 1962). Первичным продуктом реакции является нафтол, который освобождается в результате расщепления щелочной * фосфатазой а-нафтилфосфата, вводимого в инкубационную смесь в качестве субстрата действия фермента. Диазоний 4-амино-4-метоксидина (диазоль синий 0) немедленно вступает в реакцию азосочетания с а-нафтолом по мере того, как последний образуется в процессе ферментативной реакции азосочетания, выявляется нерастворимый азокраситель коричневого цвета, отложение которого микроструктурах служит показателем активности щелочной фосфатазы. в Методика проведения реакции 1. Мазки крови готовят по обычным правилам на очищенных обезжиренных предметных стеклах и высушивают на воздухе. 2. Фиксируют высушенные мазки крови в 0,5%-ном растворе целлоидина в течение 3-5 секунд. 3. По извлечении препарата из фиксатора целлоидин с обратной стороны предметного стекла удаляют салфеткой, после чего препарат ставят в вертикальное положение на фильтровальную бумагу и дают высохнуть 3-5 минут. 4. Инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут в инкубационной смеси. 5. Промывают препараты в проточной воде в течение 5-10 минут (при этом сосуд с мазками лучше поставить под струю воды, не выливая инкубационной жидкости). 6. Ополаскивают дистиллированной водой. 7. Докрашивают ядра гематоксилином в течение 30-60 минут. 8. Ополаскивают в тетраборатном буфере, разведенном водопроводной водой ( 1:1). 9. Промывают проточной водой 3 минуты. 10.Мазки высушивают и микроскопируют. Результат: В периферической крови активность щелочной фосфатазы обнаруживается в цитоплазме некоторых сегментоядерных и реже палочкоядерных гранулоцитов. Причем, в зависимости от степени активности фермента, щелочная фосфатаза выявляется в виде диффузного окрашивания от светло-коричневого до темно-коричневого цвета. Возможно наличие зернистости аналогичной окраски. 2.2.3 Определение активности кислой фосфатазы лейкоцитоп Современные методы цитохимического выявления активности фосфатаз, которые являются гидролитическими ферментами, основаны на применении анафтилфосфата натрия или его производных и различных диазотатов. Выявление кислой фосфатазы с помощью реакции азосочетания по Goldberg и Barka (1962) в модификации В.И. Дудецкого (1970) основано на принципе одномоментного захвата. Первичным продуктом реакции является нафтол, который освобождается в результате расщепления а-нафтилфосфата, вводимого в инкубационную среду в качестве субстрата действия фермента. В инкубационной среде применяется основной раствор трисдиазония розанилина, который немедленно вступает в реакцию азосочетания с а-нафтолом, по мере того, как последний образуется в процессе ферментативной реакции. Методика проведенияреакции 1. Мазки крови готовят по обычным правилам на очищенных и обезжиренных предметных стеклах и высушивают на воздухе. 2. Фиксируют мазки крови в парах формалина в течение 1-? минут. 3. Для удаления паров фиксатора выдерживают мазки на воздухе в течение 30 минут. 4. Инкубируют мазки в течение 1,5 часов в инкубационной смеси, состоящей из равного количества инкубационных растворов 1 и 2. Инкубацию проводят в термостате при температуре +37С. 5. Промывают мазки в проточной воде в течение 15 минут. 6. Ополаскивают в дистиллированной воде. 7. Докрашивают ядра 0,25%-ным раствором «метиленового синего» в течение 30 секунд. 8. Споласкивают в проточной воде. 9. Мазки высушивают и микроскопируют. Результат: активность кислой фосфатазы выявляется в зрелых нейтрофильных гранулоцитах в виде пылевой зернистости и более крупных гранул краснокоричневого цвета разной интенсивности окраски. Приготовление инкубационного раствора 1: 90 мг а-нафтилфосфата растворяют в 26 мл дистиллированной воды и добавляют 10 мл основного раствора ацетатвероналового буфера Михаэлиса. Приготовление инкубационного раствора 2: в стакан с 1,6 мл 4%-ного раствора основного фуксина на 2 н соляной кислоте по каплям доливают 1,6 мл 4%-ного раствора нитрита натрия. Для удаления двуокиси азота добавляют 5-7 мг мочевины и |