|
нейтрофильных гранулоцитах в виде пылевой зернистости и более крупных гранул красно-коричневого цвета разной интенсивности окраски. Приготовление инкубационного раствора 1: 90 мг а-нафтилфосфата растворяют в 26 мл дистиллированной воды и добавляют 10 мл основного раствора ацетат-вероналового буфера Михаэлиса. Приготовление инкубационного раствора 2: в стакан с 1,6 мл 4%-ного раствора основного фуксина на 2 н соляной кислоте по каплям доливают 1,6 мл 4%-ного раствора нитрита натрия. Для удаления двуокиси азота добавляют 5-7 мг мочевины и встряхивают стакан до прекращения отхождения пузырьков газа. Затем инкубационные растворы сливают вместе. pH среды доводят с помощью 1 н едкого натрия до 5,5. 2.2.6 Определение спонтанного НСТ теста нейтрофильных лейкоцитов Впервые описанный в 1967-1968 годах (Baehner, Natan, 1967; Park с соавт., 1968) НСТтест прошел широкую научно-практическую апробацию. Исследования отечественных и иностранных авторов выявили ценность теста с нитросиним тетразолием Д Л Я оценки функционально-метаболической активности нейтрофильных гранулоцитов, связанную с процессом фагоцитоза (В.И. Покровский, Б.С. Нагоев, 1983). Принцип метода состоит в том, что бесцветный нитросиний тетразолий, сталкиваясь с активизированным нейтрофилом, восстанавливается в темно-синий диформазан, который откладывается в виде гранул, нерастворимых в воде и большинстве органических растворителей, внутри и на поверхности клеток. Количество выпавшего диформазана служит критерием интенсивности реакции (Klebanoff, 1985; М.Г. Шубич, В.Г. Медникова, 1978; Б.С. Нагоев, М.Г. Шубич, 1981; В.И. Покровский, Б.С. Нагоев, 1983). В настоящее время описаны различные варианты и методики определения функционально-метаболической активности лейкоцитов с помощью НСТ-теста (Park с соавт., 1968; М.Г. Шубич, В.Г. Медникова, 1978; Б.С. Нагоев, 1983; Stuart с соавт., 1975). Много вариантов и модификаций предложено на основе методики Park с соавт. (1968). Мы использовали метод Stuart с соавт. (1975) в модификации Б.С. Нагоева (1983). |
кислой фосфатазы с помощью реакции азосочетания по Goldberg и Barka (1962) в модификации В.И. Дудецкого (1970) основано на принципе одномоментного захвата. Первичным продуктом реакции является нафтол, который освобождается в результате расщепления а-нафтилфосфата, вводимого в инкубационную среду в качестве субстрата действия фермента. В инкубационной среде применяется основной раствор трисдиазония розанилина, который немедленно вступает в реакцию азосочетания с а-нафтолом, по мере того, как последний образуется в процессе ферментативной реакции. Методика проведенияреакции 1. Мазки крови готовят по обычным правилам на очищенных и обезжиренных предметных стеклах и высушивают на воздухе. 2. Фиксируют мазки крови в парах формалина в течение 1-? минут. 3. Для удаления паров фиксатора выдерживают мазки на воздухе в течение 30 минут. 4. Инкубируют мазки в течение 1,5 часов в инкубационной смеси, состоящей из равного количества инкубационных растворов 1 и 2. Инкубацию проводят в термостате при температуре +37С. 5. Промывают мазки в проточной воде в течение 15 минут. 6. Ополаскивают в дистиллированной воде. 7. Докрашивают ядра 0,25%-ным раствором «метиленового синего» в течение 30 секунд. 8. Споласкивают в проточной воде. 9. Мазки высушивают и микроскопируют. Результат: активность кислой фосфатазы выявляется в зрелых нейтрофильных гранулоцитах в виде пылевой зернистости и более крупных гранул краснокоричневого цвета разной интенсивности окраски. Приготовление инкубационного раствора 1: 90 мг а-нафтилфосфата растворяют в 26 мл дистиллированной воды и добавляют 10 мл основного раствора ацетатвероналового буфера Михаэлиса. Приготовление инкубационного раствора 2: в стакан с 1,6 мл 4%-ного раствора основного фуксина на 2 н соляной кислоте по каплям доливают 1,6 мл 4%-ного раствора нитрита натрия. Для удаления двуокиси азота добавляют 5-7 мг мочевины и 2.2.6 Цитохимическое выявление липидов Цитохимические методы выявления липидов в лейкоцитах основаны на способности инертных диазосоединений (судан III, Судан IV, судан черный и др.) растворяться в жирах. Выявление липидов в лейкоцитах периферической крови проводили Суданом III по методу Гольдмана по прописи Г.И. Раскина и Л.Б. Левинсона (1957). Методика проведения реакции 1. Мазки крови готовят по обычным правилам и высушивают на воздухе. 2. Фиксируют мазки в формалиновом спирте в течение 1-3 минут. 3. Красят в растворе Судана III в течение 10 минут. 4. Помещают в 705 этиловый спирт на 1 минуту. 5. Докрашивают красителем Романовского-Гимза в течение 5-10 минут. 6. Промывают дистиллированной водой, высушивают и микроскопируют. Результат: Липиды выявляют в лейкоцитах в виде оранжевых зерен. 2.2.7 Определение спонтанного НСТ-теста нейтрофильных лейкоцитов Впервые описанный в 1967-1968 годах (Baehner, Natan, 1967; Park с соавт., 1968) НСТ-тест прошел широкую научно-практическую апробацию. Исследования отечественных и иностранных авторов выявили ценность теста с нитросиним тетразолием для оценки функционально-метаболической активности нейтрофильных гранулоцитов, связанную с процессом фагоцитоза (В.И. Покровский, Б.С. Нагоев, 1983). Принцип метода состоит в том, что бесцветный нитросиний тетразолий, сталкиваясь с активизированным нейтрофилом, восстанавливается в темно-синий диформазан, который откладывается в виде гранул, нерастворимых в воде и большинстве органических растворителей, внутри и на поверхности клеток. Количество выпавшего диформазана служит критерием интенсивности реакции (Klebanoff, 1985; М.Г. Шубич, В.Г. Медникова, 1978; Б.С. Нагоев, М.Г. Шубич, 1981; В.И. Покровский, Б.С. Нагоев, 1983). варианты функционально-метаболической активности лейкоцитов с помощью НСТ-теста (Park с соавт., 1968; М.Г. Шубич, В.Г. Медникова, 1978; Б.С. Нагоев, 1983; Stuart с соавт., 1975). Много вариантов и модификаций предложено на основе методики Park с соавт. (1968). Мы использовали метод Stuart с соавт. (1975) в модификации Б.С. Нагоева # (1983). Методика проведения реакции 1. ОД мл крови из пальца смешивают осторожно с ОД мл раствора гепарина (1 БД в ОД мл). 2. К гепаринизированной крови добавляют ОД мл 0Д%-ного раствора нитросинего тетразолия. о 3. Инкубируют смесь 10 минут при 37 С на водяной бане. 4. Фиксируют смесь в 50%-ном растворе формалина hl 0,9%-ном растворе хлорида натрия 3 минуты. 5. Добавляют 3 мл дистиллированной воды на 20 секунд (для лизиса эритроцитов). 6. Для восстановления изотони добавляют 1 мл 3,4%-ного раствора хлорида натрия. о 7. дают отстояться при температуре 18-20 С 10 минут. 8. Центрифугируют 5 минут при 1000 об/мин. 9. Осторожно удаляют надосадочную жидкость пастеровской пипеткой. 10. Из осадка готовят мазки. 11. Фиксируют мазки 45-ном формалино-спиртовом растворе 30 секунд. 12.Докрашивают ядра 0,5%-ным раствором сафранина. 13. Высушивают и микроскопируют под иммерсионным объективом. 2.3 Количественная оценка содержания цитохимических показателей в нейтрофильных лейкоцитах Для практической цитохимии большое значение приобрел метод количественного определения активности исследуемых химических веществ (равно ферментов) в лейкоцитах по Kaplow (1955), дающий возможность сравнительной оценки полученных результатов. Этот метод позволяет определить показатель активности нейтрофильных гранулоцитов, то есть, выраг.ить количественное содержание исследуемых компонентов в условных единицах (у.е.) измерения. При оценке цветных цитохимических реакции предполагается, что интенсивность окраски |