|
Методика проведения реакции 1. 0,1 мл крови из пальца смешивают осторожно с 0,1 мл раствора гепарина (1 ЕД в 0,1 мл). 2. К гепаринизированной крови добавляют 0,1 мл 0,1%-ного раствора нитросинего тетразолия. о3. Инкубируют смесь 10 минут при 37 С на водяной бане. 4. Фиксируют смесь в 50%-ном растворе формалина на 0,9%-ном растворе хлорида натрия 3 минуты. 5. Добавляют 3 мл дистиллированной воды на 20 секунд (для лизиса эритроцитов). 6. Для восстановления изотони добавляют 1 мл 3,4%-ного раствора хлорида натрия. о7. Дают отстояться при температуре 18-20 С 10 минут. 8. Центрифугируют 5 минут при 1000 об/мин. 9. Осторожно удаляют надосадочную жидкость пастеровской пипеткой. 10. Из осадка готовят мазки. 11. Фиксируют мазки в 45%-ном формалино-спиртовом растворе 30 секунд. 12. Докрашивают ядра 0,5%-ным раствором сафранина. 13. Высушивают и микроскопируют под иммерсионным объективом. 2.3 Количественная оценка содержания цитохимических показателей в нейтрофильных лейкоцитах Для практической цитохимии большое значение приобрел метод количественного определения активности исследуемых химических веществ (равно ферментов) в лейкоцитах по Kaplow (1955), дающий возможность сравнительной оценки полученных результатов. Этот метод позволяет определить показатель активности нейтрофильных гранулоцитов, то есть, выразить количественное содержание исследуемых компонентов в условных единицах (у.е.) измерения. При оценке цветных цитохимических реакций предполагается, что интенсивность окраски и количество окрашенного материала соответствует количеству исследуемого в клетке вещества или активности фермента. Так, на примере количественного определения ферментативной активности гидролитических ферментов фосфатаз картина распределения и количества осадка азокрасителя внутри клетки по Kaplow (1955) позволяет разделить |
Много вариантов и модификаций предложено на основе методики Park с соавт. (1968). Мы использовали метод Stuart с соавт. (1975) в модификации Б.С. Нагоева # (1983). Методика проведения реакции 1. ОД мл крови из пальца смешивают осторожно с ОД мл раствора гепарина (1 БД в ОД мл). 2. К гепаринизированной крови добавляют ОД мл 0Д%-ного раствора нитросинего тетразолия. о 3. Инкубируют смесь 10 минут при 37 С на водяной бане. 4. Фиксируют смесь в 50%-ном растворе формалина hl 0,9%-ном растворе хлорида натрия 3 минуты. 5. Добавляют 3 мл дистиллированной воды на 20 секунд (для лизиса эритроцитов). 6. Для восстановления изотони добавляют 1 мл 3,4%-ного раствора хлорида натрия. о 7. дают отстояться при температуре 18-20 С 10 минут. 8. Центрифугируют 5 минут при 1000 об/мин. 9. Осторожно удаляют надосадочную жидкость пастеровской пипеткой. 10. Из осадка готовят мазки. 11. Фиксируют мазки 45-ном формалино-спиртовом растворе 30 секунд. 12.Докрашивают ядра 0,5%-ным раствором сафранина. 13. Высушивают и микроскопируют под иммерсионным объективом. 2.3 Количественная оценка содержания цитохимических показателей в нейтрофильных лейкоцитах Для практической цитохимии большое значение приобрел метод количественного определения активности исследуемых химических веществ (равно ферментов) в лейкоцитах по Kaplow (1955), дающий возможность сравнительной оценки полученных результатов. Этот метод позволяет определить показатель активности нейтрофильных гранулоцитов, то есть, выраг.ить количественное содержание исследуемых компонентов в условных единицах (у.е.) измерения. При оценке цветных цитохимических реакции предполагается, что интенсивность окраски 0. и количество окрашенного материала соответствует количеству исследуемого в клетке вещества или активности фермента. Так, на примере количественного определения ферментативной активности гидролитических ферментов фосфатаз картина распределения и количества осадка азокрасителя внутри клетки по Kaplow (1955) позволяет разделить сегментоядерные нейтрофилы на 5 типов по степени ферментативной активности (ФАН): Отсутствие активности: ядро и цитоплазма не окрашены, к этому типу следует также относить нейтрофилы с ограниченным участком желтой или светло-коричневой окраски в цитоплазме вблизи ядра или на периферии клетки. Низкая активность: ядро не окрашено, вся цитоплазма диффузно окрашена в светло-коричневый цвет. Возможно наличие светлокоричневой зернистости. 2. Умеренная активность: ядро не окрашено, вся цитоплазма окрашена 1. 3 4. в коричневый цвет, возможно наличие единичных темно-коричневых гранул. Высокая активность: ядро не окрашено, вся цитоплазма окрашена в темно-коричневый цвет. Возможно наличие гранул и участков потемнения. Очень высокая активность: интенсивная темно-коричневая или черно-коричневая окраска цитоплазмы с массивным отложением азокрасителя в области ядра. Что можно объяснить диффузией продуктов реакции. Для количественной оценки активности НСТ-теста с учетом метода Kaplow (1955) нами использован описанный В.И. Покровским и Б.С. Нагоевым (1983) принцип оценки реакции в лейкоцитах по интенсивности и насыщенности. Для этого по степени активности реакции все клетки подразделялись на 4 группы. В нулевую группу относили нейтрофилы гранул; в первую группу включались клетки содержащие единичные гранулы, или площадь окраски которых занимала до 25-35% цитоплазмы (I степень активности); во вторую группу —нейтрофилы, цитоплазма которых на 30-70 % была занята гранулами формазана (II степень активности) и в |