|
35 Определение содержания плацентарного (ТБГ) и эндометриального (ПАМГ) белков в сыворотке крови. Определение концентрации ТБГ и ПАМГ в сыворотке крови проводили иммуноферментным сэндвич-методом. 96-луночные планшеты («Соз1аг») сенсибилизировали МАТ 4В (1Омкг/мл) на карбонат бикарбонатном буфере рН 9,5. В лунки вносили по 100 мкл стандарта антигена в разведениях (от 100 до 0,7нг/мл) и тестируемые сыворотки, инкубировали в течение 1 часа при 37°С и затем добавляли по 100 мкл конъюгата МАТ ДЗ с пероксидазой в разведении 1:1000. После инкубации при 37°С в течение 1 ч. вносили 0,4% раствор фенилендиамина в цитрат-фосфатном буфере рН 4,7 с 0,1% перекиси водорода. Через 20 мин. реакцию останавливали 50% серной кислотой. Результаты учитывали на «МиШзкапТЙеПек,Н очу» . Морфологическое и морфометрическое исследование плацентарного ложа и плаценты. Морфометрическое и морфологическое исследование плацент. Исследование плацент проводилось по стандартизированной схеме (Милованов А.П.,1999), которая включала макроскопический анализ, вырезку материала и гистологическое изучение в три этапа. После макроскопического исследования проводили органометрическое определение массы плаценты без оболочек и пуповины, а затем ее объем по вытесненной воде в мерном цилиндре. Для определения её площади плаценту материнской поверхностью укладывали на лист чистой бумаги и карандашом очерчивали ее контур; далее на этот отпечаток переносились контуры обнаруженной макропатологии для последующего расчета процента площади патологических очагов к общей площади материнской поверхности плаценты. После этого проводилась вырезка материала: 6 кусочков плацентарной ткани (2 из краевой, 2 —из парацентральной и 2 —из центральной зон), а также срединная часть пуповины и спираль из оболочек. |
дополнительной стабилизации лизосомных мембран в инкубационную смесь вводили 0,7 М сахарозы. I • I • • " % • . 4 г "• . 1 • ' К 100 мкл инкубационной смеси добавляли 20 мкл исследуемого материала (для определения ОА и ДА фракции тканей разводились в соотношении 1:5). Инкубация при 37°С для материалов из плазмы и тканей в течение 20 минут. Реакцию останавливали 0,5 мл холодного раствора ШКагСОз. Содержимое пробирок центрифугировали при ЗОООоб./Юмин. Фотоколориметрировали в микрокюветах на спектрофотометре ОИ-8В "Вескшап" (США) при длине волны 405 нм (]М-ацетил-Р-0-глк>козаминидаза) и 555 нм (Р-Б-глюкуронидаза). В контрольном опыте исследуемый материал добавляли после остановки реакции. Опытный и контрольный образцы спектрофотометрировали против компенсационного раствора, содержащего 20 мкл соответствующего гомогенизационного буфера, 100 мкл 0,2 М ацетатного буфера, рН 5,5, 0,7 М сахароза и 0,5 мл М №гСОз. Коэффициенты молярной экстинкции 4-нитрофенол и фенолфталеина определяли по стандартным кривым, построенным при фотометрировании стандартных растворов 4-нитрофенола ("Реахим") и фенолфталеина ("Реахим") в 1М Ыа2СОэ. Активность ферментов выражали в нмоль освобожденного за 1 мин. из субстрата 4-нитрофенола или фенолфталеина на 1 мг белка в исследуемом материале. Количество белка в пробе определяли по методу Ьо'ту в модификации С.П. Сяткина. Определение содержания плацентарных и эндометриальных белков (ТБГ, ПАМГ) в сыворотке крови. Определение концентрации ТБГ и ПАМГ в сыворотке крови проводили иммуноферментным сэндвич-методом. 96-луночные планшеты («Соз1аг») сенсибилизировали МАТ 4В (10мкг/мл) на карбонат бикарбонатом буфере рН 9,5. В лунки вносили по 100 мкл стандарта антигена в разведениях (от 100 до 0,7нг/мл) и тестируемые сыворотки, инкубировали в течение 1часа при 37°С и затем добавляли по 100 мкл конъюгата МАТ ДЗ с пероксидазой в разведении 1:1000. После инкубации при 37°С в течение 1 ч. вносили 0,4% раствор фенилендиамина в цитрат-фосфатном буфере рН 4,7 с 0,1% перекиси водорода. Через 20 мин. реакцию останавливали 50% серной кислотой. Результаты учитывали на «МиШзкап ТДеПек,Н от. Морфологическое и морфометрическое исследование плацентарного ложа и плаценты. Морфометрическое и морфологическое исследование плацент. Исследование плацент проводилось по стандартизированной схеме (А.П. Милованов, 1999), которая включала макроскопический анализ, вырезку материала и гистологическое изучение в три этапа. После макроскопического исследования проводили определение массы плаценты без оболочек и пуповины, а затем ее объем по вытесненной воде в мерном цилиндре. Для этого плаценту материнской поверхностью укладывали на лист чистой бумаги и карандашом очерчивали ее контур; далее на этот отпечаток переносились контуры гематомы для последующего расчета процента площади гематомы к общей площади материнской поверхности плаценты. Площадь материнской поверхности определяли также по отпечатку свежей плаценты на чистой бумаге. По отпечатку, с помощью специальной прозрачной сантиметровой сетки, рассчитывали площадь материнской поверхности. Кроме того, исходя из массы плаценты и плода, определяли плацентарно-плодовый коэффициент. Подсчитано количество точек, падающих на фибриноид, спиральных артерий (СА), вневорсинчатого цитотрофобласта (УСТ), многоядерных гигантских клеток (МГК). Изучено состояние СА и УСТ как важнейших показателей компенсаторноприспособительной реакции ПЛ. |