|
раствора, медленно. Затем, через 15 минут из другой кубитальной вены осуществляется забор крови в количестве 10 мл в пластиковую пробирку, содержащую цитрат натрия, в соотношении 9:1 для предотвращения свертывания. 3. Образец крови Центрифугировать при 5000 об/мин в течение 10 мин, затем отобрать 3 мл плазмы, которые используются для исследования. При невозможности определения концентрации МЕОХ в тот же день, образец плазмы поместить в холодильник при температуре -70°С. 4. К образцу плазмы добавить 0,15 мл спиртового раствора внутреннего стандарта -МРОХ в концентрации 10000 нг/мл. В этом случае концентрация МРОХ в образце плазмы составит 500 нг/мл. 5. После чего полученный раствор пропускают через концентрирующий патрон 180ШГЕ С18, 100мг/1мл, который предварительно подвергся кондиционированию последовательно 1 мл дистиллированной Н20 и 1 мл метанола. 6. Затем проводилось элюирование последовательно 5 мл дистиллированной Н20 и 2 мл 10% раствора метанола в дистиллированной Н20 7. Смыв аналита проводился 3 мл метанола. 8. Полученный экстракт испарять под вакуумом при комнатной температуре с использованием водоструйного насоса. 9. Сухой остаток растворить в 80 мкл метанола и использовать полученный раствор для хроматографирования. 10. Условия хроматографирования: скорость потока 1 мл/мин. Длина волны детектирования 205 нм. Температура 25°С. 11. Регистрацию времени выхода МЕСХ и МРОХ проводить, используя программное обеспечение ЗЫшабги С1а$5-УР при длине волны 205 нм. Время выхода МЕСХ при использовании данной методики составляет 9 мин, МРОХ 14 мин. 12. Если методика будет воспроизводиться 76 на другом |
102 щую цитрат натрия, в соотношении 9:1 для предотвращения свертывания. 3. Образец крови центрифугировать при $000 об/мин в течение 10 мин, затем отобрать 5 мл плазмы, которые используются для исследования. При невозможности определения концентрации МЕОХ в тот же день, образец плазмы поместить в холодильник при температуре -70°С. 4. К образцу плазмы добавить 0,208 мл спиртовою раствора внутреннего стандарта триметоприма в концентрации $ мкг/мл. В этом случае концентрация триметоприма в образце плазмы составит 200 нг/мл. 5. После чего к полученному раствору добавить 2$ мкл 2М раствора ЫаОП и измерить рН, которая должна быть в пределах 9,0-9,5. 6. Провести трехкратную экстракцию 1,2-дихлорэтаном к изучаемому образцу плазмы добавить 1 мл 1,2-дихлорэгана, встряхивать в течение 1 минуты, центрифугировать при 7000 об/мин в течение 15 минут, затем отобрать нижний (органический) слой и поместить в чистую стеклянную пробирку. Экстракцию повторить еще 2 раза. После чего все три экстракта объединить в одну пробу. Процесс экстракции проводится обязательно в вытяжном шкафу. 7. Полученный экстракт испарять под вакуумом при комнатной температуре с использованием водоструйного насоса. 8. Сухой остаток растворить в 100 мкл 0,05М калийфосфатного буфера (рН=2,9) и использовать полученный раствор для хроматографирования. 9. Условия хроматографирования: скорость потока 0,8 мл/мин. Длина волны детектирования 20$ нм. Температура 25°С. 10. Регистрацию времени выхода МЕОХ и триметоприма проводить, используя программное обеспечение $Ышас1ги С1а$$-УР при длине волны 205 нм. Время выхода МЕОХ при использовании данной методики составляет 4,9 мин, триметоприма 6,3 мин. 11. Если методика будет воспроизводиться на другом хроматографическом оборудовании, то необходимо включить этап построения калибровочных кривых (по воде и по плазме). Для построения данных кривых используют стандартные растворы МЕСХ и триметоприма и рассчитывают отношения |