|
хроматографическом оборудовании, то необходимо включить этап построения калибровочных кривых (по воде и по плазме). Для построения данных кривых используют стандартные растворы МЕСХ и МРСХ и рассчитывают отношения площадей пиков и их зависимость от концентрации, с расчетом междневной и внутридневной ошибки для оценки воспроизводимости. 13. Для количественной оценки концентрации МЕСХ в плазме крови использовать зависимость величины, являющейся отношением площади пика МЕСХ к площади пика МРСХ от концентрации МЕСХ в плазме крови у = 0,0496х + 0,3447, где х концентрация МЕСХ в плазме крови, нг/мл, а у величина отношения площади пика МЕСХ к площади пика МРСХ, ед. 3.2 Определение активности изофермента СУР2С9. Определение активности изофермента СУР2С9 проводилось с спользованием пробы с лозартаном. За основу была взята методика, предложенная ВаЬао&1и М. с совторами (ВаЬао§1и М.О., Уазаг II., ^апбЬег^ М. е1 а1., 2004). Сущность метода заключается в использовании специфического маркера, метаболизируемого с участием системы цитохрома СУР2С9. В моче пациента определялась концентрация специфического маркера и его метаболита через определенное время после введения. В зависимости от соотношения концентраций специфического маркера и его метаболита в моче оценивалась функциональная активность системы цитохрома СУР2С9. В качестве маркера по данной методике использовался лозартан и его метаболит ЕХР3174. Концентрацию лозартана и ЕХР3174 определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), с использованием хроматографа с флуоресцентным детектором, через 8 часов после перорального приема лозартана в однократной дозе 25 мг перед сном, через 2 часа после приема пищи. Кроме того, определялась концентрация лозартана и ЕХР3174 концентраций лозартана в суточной моче (по прошествии 24 часов с момента перорального приема). После приема 25 мг лозартана, на 77 |
79 Оцениваемые в исследовании переменные (признаки): • Значение МЕОХ-теста (нг/мл). • Среднее САД и ДАД. • УровеньАлАТ • УровеньАсАТ • УровеньЩФ • Уровень билирубина • Тимоловая проба • Уровень глюкозы крови натощак • Уровень глюкозы крови после ПГТТ • Уровень общего холестерина • Уровень креатинина крови • Значение пробы Реберга 2.Методы исследования. 2.1 Оценка функциональной активности цитохрома Р-450 СУРЗА4. Активность системы цитохрома Р-450 СУРЗА4 оценивалась на основании МЕОХ-теста. За основу была взята методика, предложенная Кукесом В.Г. и соавт (2004). Сущность метода заключается в использовании специфического маркера, метабол и зируем ого с участием системы цитохрома СУРЗА4. В крови пациента определялась концентрация метаболита через определенное время после введения. В зависимости от концентрации метаболита в плазме крови оценивалась функциональная активность системы цитохрома СУРЗА4. В качестве маркера по данной методике использовался лидокаин и его метаболит моноэтилглицинксил идид (М КОХ). Концентрацию МЕОХ определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), с использованием хроматографа с флуоресцентным детектором, через 15 минут после в/в введения лидокаина в дозе 1 мг/кг массы тела пациента. 102 щую цитрат натрия, в соотношении 9:1 для предотвращения свертывания. 3. Образец крови центрифугировать при $000 об/мин в течение 10 мин, затем отобрать 5 мл плазмы, которые используются для исследования. При невозможности определения концентрации МЕОХ в тот же день, образец плазмы поместить в холодильник при температуре -70°С. 4. К образцу плазмы добавить 0,208 мл спиртовою раствора внутреннего стандарта триметоприма в концентрации $ мкг/мл. В этом случае концентрация триметоприма в образце плазмы составит 200 нг/мл. 5. После чего к полученному раствору добавить 2$ мкл 2М раствора ЫаОП и измерить рН, которая должна быть в пределах 9,0-9,5. 6. Провести трехкратную экстракцию 1,2-дихлорэтаном к изучаемому образцу плазмы добавить 1 мл 1,2-дихлорэгана, встряхивать в течение 1 минуты, центрифугировать при 7000 об/мин в течение 15 минут, затем отобрать нижний (органический) слой и поместить в чистую стеклянную пробирку. Экстракцию повторить еще 2 раза. После чего все три экстракта объединить в одну пробу. Процесс экстракции проводится обязательно в вытяжном шкафу. 7. Полученный экстракт испарять под вакуумом при комнатной температуре с использованием водоструйного насоса. 8. Сухой остаток растворить в 100 мкл 0,05М калийфосфатного буфера (рН=2,9) и использовать полученный раствор для хроматографирования. 9. Условия хроматографирования: скорость потока 0,8 мл/мин. Длина волны детектирования 20$ нм. Температура 25°С. 10. Регистрацию времени выхода МЕОХ и триметоприма проводить, используя программное обеспечение $Ышас1ги С1а$$-УР при длине волны 205 нм. Время выхода МЕОХ при использовании данной методики составляет 4,9 мин, триметоприма 6,3 мин. 11. Если методика будет воспроизводиться на другом хроматографическом оборудовании, то необходимо включить этап построения калибровочных кривых (по воде и по плазме). Для построения данных кривых используют стандартные растворы МЕСХ и триметоприма и рассчитывают отношения площадей пиков и их зависимость от концентрации, с расчетом междневной и 103 внутридневной ошибки для оценки воспроизводимости. 12,Для количественной оценки концентрации МЕСХ в плазме крови использовать зависимость величины, являющейся отношением площади пика МЕСХ к площади пика триметоприма от концентрации МЕСХ в плазме крови у = 0,0024х + 0,0329, где х концентрация МЕСХ в плазме крови, нг/мл, а у ~ величина отношения площади пика МЕСХ к площади пика триметоприма, сд. (рис. 17) /V О го 2 ш X о. го X зг с с о 1о 25 X «5 о. го ►3 го о X с X с с о> X сс X го й) 3 3 о о ц X с. о и: 0 50 100 150 200 концентрация МЕОХ, нг/мл 250 Рис. 17 Зависимость отношения площади пика МЕСХ к площади пика триметоприма (200 нг/мл) от концентрации МЕСХ. |