|
С парафиновых блоков готовили серийные срезы толщиной 4 мкм. Для окрашивания микропрепаратов применяли растворы красителей, приготовленные по общепринятым прописям (Пирс Э., 1962; Лили Р.Д., 1969; Сапожников Л.Г., Доросевич А.Е., 2000). С целью проведения обзорной микроскопии материала применяли окраску гематоксилином и эозином. Для определения соединительной ткани применяли окраску пикрофуксином по Ван Гизону. Таблица 1 Протокол обработки тканей в аппарате карусельного чипа STP-120 (Microm, Германия) Этап Реагент Время, час: мин ротация (0,1,2) 1 формалин 1:00 2 2 формалин 1:00 2 3 изопропанол 1:00 2 4 изопропанол 2:00 2 5 изопропанол 3:00 2 6 изопропанол 4:00 2 7 изопропанол 4:00 2 8 изопропанол 4:00 2 9 изопропанол 4:00 2 10 изопропанол 2:00 2 11 Парафин Т 2:00 1 12 Парафин II 2:00 1 |
4. Морфологический раздел работы выполнен на кафедре патологической анатомии с курсом клинической патологии ОмГМА (зав. доктор медицинских наук, профессор Кононов А.В.). Операционный материал удаленные миоматозные узлы, близлежащий миометрий в зоне миомэктомии перед помещением в фиксатор:(1 0 %-й нейтральный забуференный формалин.на фосфатном буферепри рН=7,2-7,4)надрезали: через каждые 4-5 мм дляобеспечения адекватного проникновения в ткань формалина. Вырезку 2 кусочков из центра и из периферических отделов*узла, близлежащего миометрияпроводили через 5-8 часов после доставки материала в лабораторию. Толщина кусочков составляла 2-3 мм; Общая*продолжительность фиксации составляла 18-24' часа. Перед проводкой материал помещали в гистологические кассеты Paraform (Sacura, Япония) и TurboFlow (Microm, Германия). Далее материал обезвоживали в абсолютном изопро-лиловом спирте и пропитывали парафином в гистологическом аппарате карусельного* типа STP-120 (Microm, Германия). Приводим протокол, обработки в таблице 1. Заливку ткани проводили с использованием модульной станции ЕС-350(Microm, Германия); Для* гистологической резки* объектов* применяли ротационные микротомы-полуавтоматы НМ-335 и НМ-340Е, последний с системой водного переноса срезов STS (Microm, Германия). G парафиновых блоков готовили серийные срезы толщиной 4 мкм. Для окрашивания микропрепаратов применяли растворы красителей, приготовленные по общепринятым прописям (Пирс Э., 1962; Лили Р.Д., 1969; Сапожников А.ГМДоросевич А.Е., 2000). С целью проведения обзорной микроскопии материала применяли^ окраску гематоксилином и эозином. Для определения соединительной ткани применяли окраску пикрофуксином по Ван Гизону. Таблица1 Протокол обработки тканей в аппарате карусельного типа STP-120 (Microm, Германия) Этап Реагент Время, час: мин ротация (0 ,1 ,2 ) 1 формалин 1 : 0 0 2 2 формалин 1 : 0 0 2 3 изопропанол 1 : 0 0 2 4 изопропанол 2 : 0 0 2 5 изопропанол 3:00 2 6 изопропанол 4:00 2 7 изопропанол 4:00 2 8 изопропанол 4:00 2 9 изопропанол 4:00 2 1 0 изопропанол 2 : 0 0 2 1 1 Парафин I 2 : 0 0 1 1 2 Парафин II 2 : 0 0 1 Иммуногистохимические реакции проводили на парафиновых срезах с применением стрептавидин-биотинового метода. В качестве первичных антител использовали мышиные моноклональные антитела к а-рецепторам эстрогена и прогестерона, применяли систему детекции LSAB2 (“DAKO”, Дания), хромогеном являлся диаминобензидин. В таблице 2 представлен перечень моноклональных антител, использованных в работе. Все антитела были предназначены для работы на парафиновых срезах. Срезы помещали на предметные адгезивные стекла Polysine («Menzel», Германия). После тщательного высушивания стекла депарафинизировали в 3 объемах ксилола по 1 0 минут в каждом с последующей регидратацией последовательно в 1 объеме 95°, 1 объеме 80°, 1 объеме 70° этанола. По окончании этапа регидратации и отмывки в растворе трис-буфера (рН=7,2-7,4), приступали к иммуногисгохимическому исследованию. Для демаскировки антигенов применяли процедуру кипячения на водяной бане в течение 1 часа при |