|
Им муно гистохимические реакции проводили на парафиновых срезах с применением стрептавидин-биоти нового метода. В качестве первичных антител использовали мышиные моноклональные антитела к а-рецснторам эстрогена и прогестерона, применяли систему детекции LSAB2 (“DAKO”, Дания), хромогеном являлся диаминобензидин. В таблице 2 представлен перечень моноклональных антител, использован!*ых в работе. Все антитела были предназначены для работы на парафиновых срезах. Срезы помещали на предметные адгезивные стекла Polysine («Menzel», Германия). После тщательного высушивания стекла депарафинизировали в 3 объемах ксилола по 10 минут в каждом с последующей регидратацией последовательно в 1 объеме 95°, 1 объеме 80°, 1 объеме 70° этанола. По окончании этапа регидратации и отмывки в растворе трис-буф ера (рН=7,2-7,4) приступали к иммуhoi истохимическому исследованию. Для демаскировки антигенов применяли процедуру кипячении на водяной бане в течение 1 часа при использовании нитратного буфера (pH— 6,0). После отмывки в буфере наносили пероксидазный блок в течение 5 минут. По окончании инкубации и отмывок в буфере на препарат наносили блокирующий неспецифическое связывание протеинблок, а затем моноклональные анти тела (инкубация с антителами в течение 40 минут при t 37°С). После окончания инкубации препараты тщательно отмывали в трис-буфсре (рН=7,2-7,4), обрабатывали вторичными биотинилированными антителами и затем комплексом стрептавидин-пероксидаза (каждый этап 20 мин при I 37°С), входивших в систему детекции. После тщательной отмывки трис-буфером срезы обрабатывали хромогенным субстратом (3.3 диаминобензидин в буферном растворе). Препараты докрашивали гематоксилином Майера в течение 30 секунд. Затем препараты дегидратировали в спиртах, осветляли в 2 объехмах ксилола и заключали в монтирующую среду (Shandon Mount, США) под покровное стекло. |
Таблица1 Протокол обработки тканей в аппарате карусельного типа STP-120 (Microm, Германия) Этап Реагент Время, час: мин ротация (0 ,1 ,2 ) 1 формалин 1 : 0 0 2 2 формалин 1 : 0 0 2 3 изопропанол 1 : 0 0 2 4 изопропанол 2 : 0 0 2 5 изопропанол 3:00 2 6 изопропанол 4:00 2 7 изопропанол 4:00 2 8 изопропанол 4:00 2 9 изопропанол 4:00 2 1 0 изопропанол 2 : 0 0 2 1 1 Парафин I 2 : 0 0 1 1 2 Парафин II 2 : 0 0 1 Иммуногистохимические реакции проводили на парафиновых срезах с применением стрептавидин-биотинового метода. В качестве первичных антител использовали мышиные моноклональные антитела к а-рецепторам эстрогена и прогестерона, применяли систему детекции LSAB2 (“DAKO”, Дания), хромогеном являлся диаминобензидин. В таблице 2 представлен перечень моноклональных антител, использованных в работе. Все антитела были предназначены для работы на парафиновых срезах. Срезы помещали на предметные адгезивные стекла Polysine («Menzel», Германия). После тщательного высушивания стекла депарафинизировали в 3 объемах ксилола по 1 0 минут в каждом с последующей регидратацией последовательно в 1 объеме 95°, 1 объеме 80°, 1 объеме 70° этанола. По окончании этапа регидратации и отмывки в растворе трис-буфера (рН=7,2-7,4), приступали к иммуногисгохимическому исследованию. Для демаскировки антигенов применяли процедуру кипячения на водяной бане в течение 1 часа при использовании цитратного буфера (рН=6,0). После отмывки в буфере наносили пероксидазный блок в течение 5 минут. По окончании инкубации и отмывок в буфере на препарат наносили блокирующий неспецифическое связывание протеин-блок, а затем моноклональные антитела (инкубация с антителами в течение 40 минут при t = 37°С). После окончания инкубации препараты тщательно отмывали с трис-буфере (рН=7,2-7,4), обрабатывали вторичными биотинилированными антителами и затем комплексом стрептавидинпероксидаза (каждый этап 20 мин при t = 37°С), входивших в*систему детекции: После тщательной отмывки трис-буфером срезы обрабатывали хромогенным субстратом (3,3 диаминобензидин в буферном растворе). Препараты докрашивали гематоксилином Майера в течение 30 секунд. Затем препараты дегидратировали в спиртах, осветляли в 2 объемах ксилола, и заключали в монтирующую среду (Shandon Mount, США) под покровное стекло. Использование каждого вида антител сопровождалось постановкой контрольных реакций на серийных срезах. Иммуноморфологическую оценку препарата начинали с просмотра негативного контроля. В случае отсутствия окрашивания, в том числе и фонового, приступали к анализу исследуемого материала. Таблица 2 Панель антител, использованная'в иммуногистохимическом исследовании Искомый антиген Клон антител Рабочее разведение Фирма изготовитель Ki67 MIB-1 Готовые к использованию (без разведения, ready to use) “DAKO”, Дания а-рецепторы к эстрогену 1D5 Готовые к использованию (без разведения, ready to use) “DAKO”, Дания Рецепторы к прогестерону клон PgR 636 Готовые к использованию (без разведения, ready to use) “DAKO”, Дания |