Использование каждого вида антител сопровождалось постановкой контрольных реакций на серийных срезах. Иммуноморфологическую оценку препарата начинали с просмотра негативного контроля. В случае отсутствия окрашивания, в том числе и фонового, приступали к анализу исследуемого материала. Таблица 2 Панель антител, использованная в иммуногистохимическом исследовании Искомый антиген Клон антител Рабочее разнедение Фирма изготоI витель Ki67 MIB-1 Готовые к использованию (без разведения, ready to use) “DAK.O”, Дания а-рецепторы к эстрогену 1D5 Готовые к использованию (без разведения, ready to use) “DAKO”, Дания Рецепторы к прогестерону клон PgR 636 Готовые к использованию (без разведения, ready to use) “DAKO”, Дания При иммуногистохимическом исследовании для оценки экспрессии рецепторов определяли индекс экспрессии (ИЭ) иммунореактивный счет (immunoreactiva score, IRS) согласно рекомендациям, уже устоявшимся в практике исследований (Remmele W. et al., 1986; Torgsten G. et al., 2009): ИЭ= процент позитивных клеток х интенсивность реакции Процент позитивных клеток для расчета индекса оценивали нолуколичествснно: нет метки 0, 1-9% позитивных клеток I, 10-50% позитивных клеток 2, 51-80% позитивных клеток 3, более 80% позитивных клеток 4. Интенсивность окраски полуколичественно определяли следующим образом: 0нет реакции, 1 слабая (светло-коричневое окрашивание метки), 2 умеренная (коричневое окрашивание метки), 3 выраженная (темнокоричневое окрашивание метки). |
использовании цитратного буфера (рН=6,0). После отмывки в буфере наносили пероксидазный блок в течение 5 минут. По окончании инкубации и отмывок в буфере на препарат наносили блокирующий неспецифическое связывание протеин-блок, а затем моноклональные антитела (инкубация с антителами в течение 40 минут при t = 37°С). После окончания инкубации препараты тщательно отмывали с трис-буфере (рН=7,2-7,4), обрабатывали вторичными биотинилированными антителами и затем комплексом стрептавидинпероксидаза (каждый этап 20 мин при t = 37°С), входивших в*систему детекции: После тщательной отмывки трис-буфером срезы обрабатывали хромогенным субстратом (3,3 диаминобензидин в буферном растворе). Препараты докрашивали гематоксилином Майера в течение 30 секунд. Затем препараты дегидратировали в спиртах, осветляли в 2 объемах ксилола, и заключали в монтирующую среду (Shandon Mount, США) под покровное стекло. Использование каждого вида антител сопровождалось постановкой контрольных реакций на серийных срезах. Иммуноморфологическую оценку препарата начинали с просмотра негативного контроля. В случае отсутствия окрашивания, в том числе и фонового, приступали к анализу исследуемого материала. Таблица 2 Панель антител, использованная'в иммуногистохимическом исследовании Искомый антиген Клон антител Рабочее разведение Фирма изготовитель Ki67 MIB-1 Готовые к использованию (без разведения, ready to use) “DAKO”, Дания а-рецепторы к эстрогену 1D5 Готовые к использованию (без разведения, ready to use) “DAKO”, Дания Рецепторы к прогестерону клон PgR 636 Готовые к использованию (без разведения, ready to use) “DAKO”, Дания |