t 41 Фагоцитарную активность нейтрофилов крови определяли по фагоцитозу убитой взвеси Staph. Aureus и бактерицидности в спонтанном и индуцированном NST-тесте спектрофотометрическим методом (Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., 1995). 2.5. Определение уровня цитокинов Исследование уровня цитокинов проводилось в лаборатории онтогенеза и коррекции системы интерферона ГУ НИИ Эпидемиологии и Микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи под руководством проф., д.б.н. Малиновской В.В. Уровень синтеза ИФН-а и цитокинов исследовали методом иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием тестсистемы «Протеиновый контур» (г.Санкт-Петербург). Нормальное содержание цитокинов 0-50 пг/мл (0-30 пг/мл для ИЛ-18). Образцы, стандарты, антитела и другие реагенты вносились в количествах и в последовательности заданной инструкцией, прилагаемой к набору тест-системы. Принцип определения цитокинов методом ELISA: I этап забор крови и получение образцов плазмы и супернатантов. Кровь забирается из вены в объеме 5 мл и более и переносится в центрифужную пробирку, содержащую 10-20 ед.гепарина. Постановка тестов производится в день забора крови. II этап тесты ставятся в 24-луночных стерильных плоскодонных планшетах. Кровь разводится в соотношении 1:10 средой Игла или RPMI1640 с добавлением 2% ЭТС, глютамина и гентамицина. В каждую лунку вносится по 1 мл или 2 мл разведенной крови (количество лунок и объем разведенной крови зависит от количества определяемых параметров и особенности постановки тест-системы). Первые лунки контрольные (для постановки и дальнейшего определения не индуцированной — спонтанной продукции), остальные лунки для постановки и дальнейшего определения индуцированной продукции цитокинов (по 100 мкл стафилококкового |
50 До лечения, каждые 6 месяцев, при окончании терапии и в те же интервалы катамнеза больным определяли уровень гормонов щитовидной железы (Т3свободный, Т4свободный), тиреотропного гормона (ТТГ) и аутоиммунных антител (ANA антинуклеарные антитела, АМА анти митохондриальные антитела). 2.3 Специфическая диагностика вирусного гепатита у больных. Сыворотки крови всех больных исследовали на специфические маркеры вирусных гепатитов В, С, Д в лаборатории I (НИИЭ методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) (ELISA-тест) на спектрофотометре «Multiscan Rc» («Labsystems», Финляндия) РНК вируса гепатита С определялась в сыворотке крови и у 12 пациентов в ткани печени методом полимеразной цепной реакции в лаборатории ЦНИИ Эпидемиологии с использованием тест-системы «АмплиСенс HCV-240/BKO-440» (ЦНИИЭ, Москва). Генотипирование вируса гепатита С проводилось до лечения с помощью коммерческой тест-системы «АмплиСенс HVC-генотип» (ЦНИИЭ, Москва). В основе принципа генотипирования лежит амплификация с праймерами, специфичными для разных генотипов. 2.4 Определение состояния системы интерферона и цитокинов. Исследование показателей системы интерферона и цитокинов проводилось в лаборатории онтогенеза и коррекции системы интерферона ГУ НИИ Эпидемиологии и Микробиологии им.Н.Ф. Гамалеи под руководством проф., д.б.н. Малиновской В.В. Уровень синтеза ИФН-а и цитокинов учитывали методом иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием тест-системы «Протеиновый контур» (г.Санкт-Петербург), ИФН-у также методом ИФА с использованием тест-системы «Biosourse» (США). Определялось количество сывороточного, спонтанного ИФН, уровень продукции лейкоцитами периферической крови ИФН-а, ИФН-у при 50 51 соответствующей индукции in vitro. Показатель синтеза ИФН-а и ИФН-у у здоровых доноров составлял 200-700 пг/мл. Норма сывороточного и спонтанного ИФН-а 0-30 пг/мл, а сывороточного и спонтанного ИФН-у 03 пг/мл. Нормальное содержание цитокинов 0-50 пг/мл (0-30 пг/мл для ИЛ18). Образцы, стандарты, антитела и другие реагенты вносились в количествах и в последовательности заданной инструкцией, прилагаемой к набору тест-системы. Принцип определения человеческих интерферонов и цитокинов методом ELISA: I этап забор крови и получение образцов плазмы и супернатантов. Кровь забирается из вены в объеме 5 мл и более и переносится в центрифужную пробирку, содержащую 10-20 ед.гепарина. Постановка тестов производится в день забора крови. II этап тесты ставятся в 24-луночных стерильных плоскодонных планшетах. Кровь разводится в соотношении 1:10 средой Игла или RPMI1640 с добавлением 2% ЭТС, глютамина и гентамицина. В каждую лунку вносится по 1 мл или 2 мл разведенной крови (количество лунок и объем разведенной крови зависит от количества определяемых параметров и особенности постановки тест-системы). Первые лунки контрольные (для постановки и дальнейшего определения не индуцированной спонтанной продукции), остальные лунки для постановки и дальнейшего определения индуцированной продукции интерферонов и цитокинов (по 100 мкл вируса болезни Ньюкастла (ВБН) для индукции ИФН-а; по 100 мкл стафилококкового энтеротоксина А (СЭА), конканаваллина А (КонА) или фитогемагглютинина (ФГА) или пирогенала (ЛПС) в оптимальных концентрациях для индукции ИФН-у и цитокинов). Планшеты закрываются стерильной крышкой и инкубируются 24 часа при 37С в атмосфере 5% С02. Оставшуюся кровь центрифугируют для получения плазмы, необходимой 51 |