|
42 энтеротоксина А (СЭА), конканаваллина А (КонА) или фитогемагглютинина (ФГА) или пирогенала (ЛПС) в оптимальных концентрациях для индукции цитокинов). Планшеты закрываются стерильной крышкой и инкубируются 24 часа при 37С в атмосфере 5% СОг. Оставшуюся кровь центрифугируют для получения плазмы, необходимой для определения цитокинов, разливают в эппиндорфы и замораживают при -20С. Ш этап через 24 часа при инкубации из лунок планшеты аккуратно отбирается супернатант, который также разливают в эппиндорфы и замораживают при 20 С для дальнейшего определения в них цитокинов. В супернатантах с ВБН проводится инактивация вируса при рН-2 в течение 3-х суток с последующим доведением до рН-7. Все пробы хранятся в холодильнике при 4С (короткий срок хранения) или -20С -40С (длительное хранение). IV этап мышиные анти-человеческие цитокин моноклональные антитела (АТ-1) (адсорбированы на пластиковом стрипованном планшете) используются для захвата цитокина образцах. Перед внесением образцов во все лунки планшета вносится цитокин-специфичные кроличьи античеловеческие моноклональные антитела (АТ-2), представленные в виде конъюгата с биотином, которые связываются с независимым эпитопом захваченного цитокин образца. Инкубация внесенных в лунки планшета исследуемых образцов и стандартов при температуре 37С при непрерывном встряхивании на шейкере в течение установленного времени (1-1,5 часа) и последующая отмывка буферным раствором установленное количество раз (3-5). V этап добавление комплекса стрептавидин-пероксидазы хрена (энзим), имеющего высокое сродство к биотину, который связывается с кроличьими анти-человеческими моноклональными антителами АТ-2, образуя 4-х членный сэндвич. Инкубация при температуре 37С при непрерывном встряхивании на шейкере в течение установленного времени |
51 соответствующей индукции in vitro. Показатель синтеза ИФН-а и ИФН-у у здоровых доноров составлял 200-700 пг/мл. Норма сывороточного и спонтанного ИФН-а 0-30 пг/мл, а сывороточного и спонтанного ИФН-у 03 пг/мл. Нормальное содержание цитокинов 0-50 пг/мл (0-30 пг/мл для ИЛ18). Образцы, стандарты, антитела и другие реагенты вносились в количествах и в последовательности заданной инструкцией, прилагаемой к набору тест-системы. Принцип определения человеческих интерферонов и цитокинов методом ELISA: I этап забор крови и получение образцов плазмы и супернатантов. Кровь забирается из вены в объеме 5 мл и более и переносится в центрифужную пробирку, содержащую 10-20 ед.гепарина. Постановка тестов производится в день забора крови. II этап тесты ставятся в 24-луночных стерильных плоскодонных планшетах. Кровь разводится в соотношении 1:10 средой Игла или RPMI1640 с добавлением 2% ЭТС, глютамина и гентамицина. В каждую лунку вносится по 1 мл или 2 мл разведенной крови (количество лунок и объем разведенной крови зависит от количества определяемых параметров и особенности постановки тест-системы). Первые лунки контрольные (для постановки и дальнейшего определения не индуцированной спонтанной продукции), остальные лунки для постановки и дальнейшего определения индуцированной продукции интерферонов и цитокинов (по 100 мкл вируса болезни Ньюкастла (ВБН) для индукции ИФН-а; по 100 мкл стафилококкового энтеротоксина А (СЭА), конканаваллина А (КонА) или фитогемагглютинина (ФГА) или пирогенала (ЛПС) в оптимальных концентрациях для индукции ИФН-у и цитокинов). Планшеты закрываются стерильной крышкой и инкубируются 24 часа при 37С в атмосфере 5% С02. Оставшуюся кровь центрифугируют для получения плазмы, необходимой 51 52 для определения интерферонов и цитокинов, разливают в эппиндорфы и замораживают при -20С. III этап через 24 часа при инкубации из лунок планшеты аккуратно отбирается супернатант, который также разливают в эппиндорфы и замораживают при 20 С для дальнейшего определения в них интерферонов и цитокинов. В супернатантах с ВБН проводится инактивация вируса при рН-2 в течение 3-х суток с последующим доведением до рН-7. Все пробы хранятся в холодильнике при 4С (короткий срок хранения) или -20С -40С (длительное хранение). IV этап мышиные анти-человеческис ИФН-а (ИФН-у, цитокин) моноклональные антитела (АТ-1) (адсорбированы на пластиковом стрипованном планшете) используются для захвата ИФН-а (ИФН-у, цитокин) образцах. Перед внесением образцов во все лунки планшета вносятся ИФН-а (ИФН-у, цитокин)-специфичные кроличьи анти-человеческие моноклональные антитела (АТ-2), представленные в виде конъюгата с биотином, которые связываются с независимым эпитопом захваченного ИФН-а (ИФН-у, цитокин) образца. Инкубация внесенных в лунки планшета исследуемых образцов и стандартов при температуре 37С при непрерывном встряхивании на шейкере в течение установленного времени (1-1,5 часа) и последующая отмывка буферным раствором установленное количество раз (3-5). V этап добавление комплекса стрептавидин-пероксидазы хрена (энзим), имеющим высокое сродство к биотину, который связывается с кроличьими анти-человеческими моноклональными антителами АТ-2, образуя 4-х членный сэндвич. Инкубация при температуре 37С при непрерывном встряхивании на шейкере в течение установленного времени (30-45 минут) и последующая отмывка буферным раствором установленное количество раз (3-5). VI этап добавление раствора, развивающего окраску (реагент (ТМБ) + субстрат (Н2Ог)), инкубация при комнатной температуре до 30 минут. После 52 |