|
специфичного для костной ткани. Специфическая последовательность коллагена I типа в моче определялась методом ИФА с использованием комерческих наборов CrossLaps ELISA Kit (Osteometer, Дания). Принцип метода следующий. Коллаген I типа составляет по оценкам более 90% органической компоненты кости и синтезируется в первую очередь в костной ткани. В ходе обновления костной ткани коллаген этого типа разрушается и экскретируется в мочу в виде небольших пептидных фрагментов. В наборе CrossLaps™ используются поликлональные антитела к аминокислотной последовательности EKAHD-(3-GGR, включающей (3-изомер (D) аспарагиновой кислоты. Сущность метода заключается в конкурентном связывании антиCrossLaps™ aHTm^ с растворимым CrossLaps™-aHraгеном или CrossLaps™антигеном, пришитым к стенкам лунок микропланшета. Сначала в лунки вносили стандарты (A-F), контроли (СО) и исследуемые образцы. Стандарты это готовые к употреблению буферы, содержащие белковый стабилизатор, детергент, консервант и различную концентрацию Cross Laps антигена: А=0 пг/мл, В=110 пг/мл, С=275 пг/мл, D= 825 пг/мл, Е= 2475 пг/мл, F=7425 пг/мл. Контроль СО это контроль мочи. Затем добавляли антитела кролика к CrossLaps™ и инкубировали в течение 1 час при комнатно После промывки лунок в них вносился конъюгат пероксидазы с антителами к иммуноглобулину кролика и планшеты инкубировались 1 часа при комнатной температуре. После второй промывки в лунки вносился с хромогенный субстрат (ТМБ). Через 15 мин реакция останавливалась путем добавления однонормальной хлорной кислоты и измерялось поглощение на спектрофотометре Depotech II на длине волны 450 нм. Отбор образцов производился следующим образом. Хотя концентрация пептида, определяемая при помощи CrossLaps™ в моче, не зависит от режима питания, однако, для воспроизводимости мы использовали вторую порцию утренней мочи. Образцы хранились не более одной недели в холодильнике (2-8°С) или в случае длительного хранения замораживались |
Специфическая последовательность коллагена I типа в моче определялась методом ИФА с использованием комерческих наборов CrossLaps ELISA Kit (Osteometer, Дания). Принцип метода следующий. Коллаген I типа составляет по оценкам более 90% органической компоненты кости и синтезируется в первую очередь в костной ткани. В ходе обновления костной ткани коллаген этого типа разрушается и экскретируется в мочу в виде небольших пептидных фрагментов. В наборе CrossLaps™ используются поликлональные антитела к аминокислотной последовательности EKAHD-p-GGR, включающей p-изомер (D) аспарагиновой кислоты. Сущность метода заключается в конкурентном связывании* анти-CrossLaps™ антител с растворимым CrossLaps™-amweHOM или CrossLaps™-aHTnreHOM, пришитым к стенкам лунок микропланшета. Сначала в лунки вносили стандарты (A-F), контроли (СО) и исследуемые образцы. Стандарты это готовые к употреблению буферы, содержащие белковый стабилизатор, детергент, консервант и различную концентрацию Cross Laps антигена: А=0 пг/мл, В=110 пг/мл, С=275 пг/мл, D= 825 пг/мл, Е= 2475 пг/мл, F=7425 пг/мл. Контроль СО это контроль мочи. Затем добавляли антитела кролика к CrossLaps™ и инкубировали в течение 1 час при комнатной температуре. После промывки лунок в них вносился конъюгат пероксидазы с антителами к иммуноглобулину кролика и планшеты инкубировались 1 часа при комнатной температуре. После второй промывки в лунки вносился с хромогенный субстрат (ТМБ). Через 15 мин реакция останавливалась путем добавления однонормальной хлорной кислоты и измерялось поглощение на спектрофотометре Depotech II на длине волны 450 нм. Отбор образцов производился следующим образом. Хотя концентрация пептида, определяемая при помощи CrossLaps™ в моче, не зависит от режима питания, однако, для воспроизводимости мы использовали вторую порцию утренней мочи. Образцы хранились не более одной недели в холодильнике (2-8°С) или в случае длительного хранения замораживались при 40°С в холодильной камере. Использовались стандарты A-F это готовые к употреблению буферы, содержащий белковый стабилизатор, детергент, консервант и различную концентрацию Cross Laps антигена. Перед анализом исследуемая моча разбавлялась стандартом А в соотношении 1:4, в объёме 50 мкл образца + 200 мкл стандарта А. После измерения полученное нами значение умножалось на фактор разведения. Процедура определения производилась следующим образом. Перед использованием все растворы выдерживались при комнатной температуре. Определялось количество стрипов, необходимых для проведения анализа. Пробы ставились в дублях. В каждой последовательности резервирвировалось 14 лунок для стандартов и контроля. Требуемое количество стрипов располагалось в рамке. До использования стрипы хранились в плотно запечатанном пакете с упаковками водопоглотителя. Далее нами все производилось по следующей схеме: 1. Внесение стандартов или образцов. В лунки вносилось по 15 мкл стандартов (пробирки A-F), контроля (пробирка СО) и исследуемых образцов. 2. Инкубация. В каждую лунку добавлялось по 100 мкл раствора первичных антиCross Laps антител. Стрипы закрывались изолентой и инкубовались 60±5 мин при комнатной температуре на микропланшетном шейкере (300 об/мин). |