|
при -40°С в холодильной Использовались стандарты A-F это готовые к употреблению буферы, содержащий белковый стабилизатор, детергент, консервант и различную концентрацию Cross Laps антигена. Перед анализом исследуемая моча разбавлялась стандартом А в соотношении 1:4, в объёме 50 мкл образца + 200 мкл стандарта А. После Ш измерения полученное нами значение умножалось на фактор разведения. Процедура определения производилась следующим образом. Перед использованием все растворы выдерживались при комнатной температуре. Определялось количество стрипов, необходимых для проведения анализа. Пробы ставились в дублях. В каждой последовательности резервирвировалось 14 лунок для стандартов и контроля. Требуемое количество стрипов располагалось в рамке. До использования стрипы хранились в плотно запечатанном пакете с упаковками водопоглотителя. далее нами все производилось по следующей схеме: 1. Внесение стандартов или образцов. В лунки вносилось по' 15 мкл стандартов (пробирки A-F), контроля (пробирка СО), и исследуемых образцов. 2. Инкубация. В каждую лунку добавлялось по 100 мкл раствора первичных антиCross Laps антител. Стрипы закрывались изолентой и инкубовались 60±5 мин при комнатной температуре на микропланшетном шейкере (300 об/мин). 3. Промывка. Промывание стрипов производилось 5 раз разбавленным промывочным раствором (промывочный раствор, разбавленный дистиллированной водой в соотношении 1:50). После каждой промывки удостоверялось, что в лунках не осталось жидкости. 4. Инкубация с конъюгатом пероксидазы. В каждую лунку вносилось по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами к Ig кролика, стрипы закрывались клеющейся лентой и инкубировались 60±5 мин при комнатной температуре на микропланшетном шейкере (300 об/мин). 5. Промывка. Выполнялись действия, описанные в п. 3. |
Отбор образцов производился следующим образом. Хотя концентрация пептида, определяемая при помощи CrossLaps™ в моче, не зависит от режима питания, однако, для воспроизводимости мы использовали вторую порцию утренней мочи. Образцы хранились не более одной недели в холодильнике (2-8°С) или в случае длительного хранения замораживались при 40°С в холодильной камере. Использовались стандарты A-F это готовые к употреблению буферы, содержащий белковый стабилизатор, детергент, консервант и различную концентрацию Cross Laps антигена. Перед анализом исследуемая моча разбавлялась стандартом А в соотношении 1:4, в объёме 50 мкл образца + 200 мкл стандарта А. После измерения полученное нами значение умножалось на фактор разведения. Процедура определения производилась следующим образом. Перед использованием все растворы выдерживались при комнатной температуре. Определялось количество стрипов, необходимых для проведения анализа. Пробы ставились в дублях. В каждой последовательности резервирвировалось 14 лунок для стандартов и контроля. Требуемое количество стрипов располагалось в рамке. До использования стрипы хранились в плотно запечатанном пакете с упаковками водопоглотителя. Далее нами все производилось по следующей схеме: 1. Внесение стандартов или образцов. В лунки вносилось по 15 мкл стандартов (пробирки A-F), контроля (пробирка СО) и исследуемых образцов. 2. Инкубация. В каждую лунку добавлялось по 100 мкл раствора первичных антиCross Laps антител. Стрипы закрывались изолентой и инкубовались 60±5 мин при комнатной температуре на микропланшетном шейкере (300 об/мин). 3. Промывка. Промывание стрипов производилось 5 раз разбавленным промывочным раствором (промывочный раствор, разбавленный дистиллированной водой в соотношении 1:50). После каждой промывки удостоверялось, что в лунках не осталось жидкости. 4. Инкубация с конъюгатом пероксидазы. В каждую лунку вносилось по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами к lg кролика, стрипы закрывались клеющейся лентой и инкубировались 60±5 мин при комнатной температуре на микропланшетном шейкере (300 об/мин). 5. Промывка. Выполнялись действия, описанные в п. 3. 6. Инкубация с хромогенным субстратом. Добавлялось по 100 мкл раствора субстрата тетраметилбензидина в каждую лунку, стрипы закрывались изолентой и инкубировались 15±2 мин при комнатной температуре в темноте на микропланшетном шейкере (300 об/мин). 7. Остановка цветной реакции. Вносилось по 100 мкл стопреагента (0,18 М сульфуриловой кислоты) в каждую лунку. 8. Измерение оптической плотности. Измерение поглощения производилось на длине волны 450 нм. Расчёт результатов производился следующим образом: 1. Вычислялось среднее значение поглощения в двух последовательностях. Строилась калибровочная кривая на координатной бумаге с полулогарифмическим масштабом. По ординате откладывайте средние значения поглощения шести стандартов (A-F), а по абсциссе соответствующие значения концентраций CrossLaps™. 2. Опредлялась концентрация контроля мочи и исследуемых образцах путем интерполяции калибровочной кривой. использовании двух высокоспецифических моноклональных антител (Mabs) к человеческому остеокальцину. Одни антитела узнают среднюю часть (аминокислотные остатки 20-43) полипептида, захватывая его, а другие, коньюгированные с пероксидазой, узнают N-конечную область (аминокислотные остатки 20-43). Дополнительно к интактному остеокальцину (1-49) детектируется N-конечный (Mid) фрагмент (1-43). Стандарты (синтетический остеокальцин), контроли и образцы вносятся в соответствующие ячейки, покрытые стрептавидином, после чего используется смесь биотинилированных антител и антител, коньюгированных с пероксидазой. Затем образовавшийся комплекс между антигеном и антителами сорбируется на поверхности, покрытой стрептавидином, через биотинилированные антитела. После добавления субстрата ТМБ и остановки реакции серной кислотой измеряются оптические плотности в ячейках при 450 нм. Сбор образцов производили следующим образом: собирали кровь из вены, избегая гемолиза, далее отделяли сыворотку от клеток в течение 3 часов после сбора крови. Образцы замораживались при температуре -40°С в холодильной камере. При растворении лиофилизованных препаратов после добавления дистиллированной воды флаконы стояли 10 минут до встряхивания. Перед использованием набора все компоненты приняли комнатную температуру (18-25° С) Требуемое количество стрипов располагалось в рамке. До использования стрипы хранились в плотно запечатанном пакете с упаковками водопоглотителя. Все анализы дублировались, 14 ячеек использовались для стандартов и контролей. Далее все производилось в следующей t |