|
6. Инкубация с хромогенным субстратом. Добавлялось по 100 мкл раствора субстрата тетраметилбензидина в каждую лунку, стрипы закрывались изолентой и инкубировались 15±2 мин при комнатной температуре в темноте на микропланшетном шейкере (300 об/мин). 7. Остановка цветной реакции. Вносилось по 100 мкл стоп-реагента (0,18 М сульфуриловой кислоты) в каждую лунку. 8. Измерение оптической плотности. Измерение поглощения производилось на длине волны 450 нм. Расчёт результатов производился следующим образом: 1. Вычислялось среднее значение поглощения в двух последовательностях. Строилась калибровочная кривая на координатной бумаге с полулогарифмическим масштабом. По ординате откладывайте средние значения поглощения шести стандартов (A-F), а по абсциссе соответствующие значения концентраций CrossLaps™. 2. Опредлялась концентрация контроля мочи и исследуемых образцах путем интерполяции калибровочной кривой. 3. Образцы с оптической плотностью, близкой к значению поглощения стандарта с наибольшей концентрацией (стандарт F), мы разбавляли в анализ Результат умножали на фактор разбавления Вычисление результатов CrossLaps™ производилось с поправкой на концентрацию креатинина. Определение креатинина проводилось биохимическим методом с помощью набора Lachema. Принцип метода следующий: в щелочной среде пикриновая кислота взаимодействует с креатинином с образованием оранжево-красной окраски, которую измеряют фотометрически. Определение в сыворотке крови проводят после депротеинизирования, в моче после разведения водой. Учет реакции проводился на спектрофотометре на длине волны 510 нм. Для каждого образца помимо концентрации CrossLaps™ (мкг/ммоль) мы определяли концентрацию креатинина (ммоль/л) и по приведённой ниже формуле |
3. Промывка. Промывание стрипов производилось 5 раз разбавленным промывочным раствором (промывочный раствор, разбавленный дистиллированной водой в соотношении 1:50). После каждой промывки удостоверялось, что в лунках не осталось жидкости. 4. Инкубация с конъюгатом пероксидазы. В каждую лунку вносилось по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами к lg кролика, стрипы закрывались клеющейся лентой и инкубировались 60±5 мин при комнатной температуре на микропланшетном шейкере (300 об/мин). 5. Промывка. Выполнялись действия, описанные в п. 3. 6. Инкубация с хромогенным субстратом. Добавлялось по 100 мкл раствора субстрата тетраметилбензидина в каждую лунку, стрипы закрывались изолентой и инкубировались 15±2 мин при комнатной температуре в темноте на микропланшетном шейкере (300 об/мин). 7. Остановка цветной реакции. Вносилось по 100 мкл стопреагента (0,18 М сульфуриловой кислоты) в каждую лунку. 8. Измерение оптической плотности. Измерение поглощения производилось на длине волны 450 нм. Расчёт результатов производился следующим образом: 1. Вычислялось среднее значение поглощения в двух последовательностях. Строилась калибровочная кривая на координатной бумаге с полулогарифмическим масштабом. По ординате откладывайте средние значения поглощения шести стандартов (A-F), а по абсциссе соответствующие значения концентраций CrossLaps™. 2. Опредлялась концентрация контроля мочи и исследуемых образцах путем интерполяции калибровочной кривой. 3. Образцы с оптической плотностью, близкой к значению поглощения стандарта с наибольшей концентрацией (стандарт F), мы разбавляли в соотношении 1:4 стандартом А в отдельной пробирке и повторяли анализ. Результат умножали на фактор разбавления. Вычисление результатов CrossLaps™ производилось с поправкой на концентрацию креатинина. Определение креатинина проводилось биохимическим методом с помощью набора Lachema. Принцип метода следующий: в щелочной среде пикриновая кислота взаимодействует с креатинином с образованием оранжево-красной окраски, которую измеряют фотометрически. Определение в сыворотке крови проводят после депротеинизирования, в моче после разведения водой. Учет реакции проводился на спектрофотометре на длине волны 510 нм. Для каждого образца помимо концентрации CrossLaps™ (мкг/ммоль) мы определяли концентрацию креатинина (ммоль/л) и по приведённой ниже формуле рассчитывали значение концентрации CrossLaps™ относительно вариаций в концентрации мочи: CrossLaps™ (мкг/л) Исправленное значениеCrossLaps™ (мкг/ммоль) =--------------------------Креатинин (ммоль/л) Точность была проверена фирмой производителем в ходе пяти последовательных анализов 4-х образцов ежедневно в течение 5 дней (в сумме 25 определений для каждого образца). |