Проверяемый текст
Баракат, Ахмад М. Али; Клинико-патогенетическое значение антител к коллагену I типа в развитии остеопороза при ревматоидном артрите (Диссертация 2005)
[стр. 62]

диагностировании пациентов с дефицитом гормона роста, гипои гипертиреозом, хроническими заболеваниями почек.
Принцип метода следующий.
Тест-система основана на использовании двух высокоспецифических моноклональных антител к человеческому остеокальцину.
Одни антитела узнают среднюю часть (аминокислотные остатки 20-43) полипептида, захватывая его, а другие,
конъюгированные с пероксидазой, узнают N-конечную область (аминокислотные остатки 20-43).
Дополнительно к интактному остеокальцину (1-49) детектируется Nконечный (Mid) фрагмент (1-43).
Стандарты (синтетический остеокальцин), контроли и образцы вносятся в соответствующие ячейки, покрытые стрептавидином, после чего*используется смесь биотинилированных антител и антител,
конъюгированных с пероксидазой.
Затем образовавшийся комплекс между антигеном и антителами сорбируется на поверхности покрытой стрептавидином, через биотинилированные антитела.
После добавления субстрата ТМБ и остановки реакции серной кислотой измеряются оптические плотности в ячейках при 450 нм.
« Сбор образцов производили следующим образом: собирали кровь из вены, избегая гемолиза, далее отделяли сыворотку от клеток в течение 3 часов после сбора крови.
Образцы замораживались при температуре -40°С в холодильной камере.
При растворении лиофилизованных препаратов после добавления дистиллированной воды флаконы
10 минут до встряхивания.
Перед использованием набора все компоненты приняли комнатную
отемпературу (18-25 С) Требуемое количество стрипов располагалось в рамке.
До использования стрипы хранились в плотно запечатанном пакете с упаковками водопоглотителя.

Все анализы дублировались, 14 ячеек использовались для стандартов и контролей.
Далее все производилось в следующей
последовательности.
Смешивался конъюгат моноклональных антител против N-терминального отрезка остеокальцина с пероксидазой и биотинилированные моноклональные антитела против mid-отрезка
[стр. 81]

Отбор образцов производился следующим образом.
Хотя концентрация пептида, определяемая при помощи CrossLaps™ в моче, не зависит от режима питания, однако, для воспроизводимости мы использовали вторую порцию утренней мочи.
Образцы хранились не более одной недели в холодильнике (2-8°С) или в случае длительного хранения замораживались при 40°С в холодильной камере.
Использовались стандарты A-F это готовые к употреблению буферы, содержащий белковый стабилизатор, детергент, консервант и различную концентрацию Cross Laps антигена.
Перед анализом исследуемая моча разбавлялась стандартом А в соотношении 1:4, в объёме 50 мкл образца + 200 мкл стандарта А.
После измерения полученное нами значение умножалось на фактор разведения.
Процедура определения производилась следующим образом.
Перед использованием все растворы выдерживались при комнатной температуре.
Определялось количество стрипов, необходимых для проведения анализа.
Пробы ставились в дублях.
В каждой последовательности резервирвировалось 14 лунок для стандартов и контроля.
Требуемое количество стрипов располагалось в рамке.
До использования стрипы хранились в плотно запечатанном пакете с упаковками водопоглотителя.

Далее нами все производилось по следующей схеме: 1.
Внесение стандартов или образцов.
В лунки вносилось по 15 мкл стандартов (пробирки A-F), контроля (пробирка СО) и исследуемых образцов.
2.
Инкубация.
В каждую лунку добавлялось по 100 мкл раствора первичных антиCross Laps антител.
Стрипы закрывались изолентой и инкубовались 60±5 мин при комнатной температуре на микропланшетном шейкере (300 об/мин).


[стр.,87]

использовании двух высокоспецифических моноклональных антител (Mabs) к человеческому остеокальцину.
Одни антитела узнают среднюю часть (аминокислотные остатки 20-43) полипептида, захватывая его, а другие,
коньюгированные с пероксидазой, узнают N-конечную область (аминокислотные остатки 20-43).
Дополнительно к интактному остеокальцину (1-49) детектируется N-конечный (Mid) фрагмент (1-43).
Стандарты (синтетический остеокальцин), контроли и образцы вносятся в соответствующие ячейки, покрытые стрептавидином, после чего используется смесь биотинилированных антител и антител,
коньюгированных с пероксидазой.
Затем образовавшийся комплекс между антигеном и антителами сорбируется на поверхности, покрытой стрептавидином, через биотинилированные антитела.
После добавления субстрата ТМБ и остановки реакции серной кислотой измеряются оптические плотности в ячейках при 450 нм.
Сбор образцов производили следующим образом: собирали кровь из вены, избегая гемолиза, далее отделяли сыворотку от клеток в течение 3 часов после сбора крови.
Образцы замораживались при температуре -40°С в холодильной камере.
При растворении лиофилизованных препаратов после добавления дистиллированной воды флаконы
стояли 10 минут до встряхивания.
Перед использованием набора все компоненты приняли комнатную
температуру (18-25° С) Требуемое количество стрипов располагалось в рамке.
До использования стрипы хранились в плотно запечатанном пакете с упаковками водопоглотителя.
Все анализы дублировались, 14 ячеек использовались для стандартов и контролей.
Далее все производилось в следующей
t

[стр.,88]

последовательности.
Смешивался коньюгат моноклональных антител против N-терминального отрезка остеокальцина с пероксидазой и биотинилированные моноклональные антитела против mid-отрезка остеокальцина по 10 мл в равных объемах обоих растворов.
Далее вносилось по 20 мкл стандартов (A-F), контролей (СО) и образцов в соответствующие ячейки, затем добавлялось по 150 мкл предварительно приготовленной смеси растворов антител.
Стандарты это готовые буферы с белковым стабилизатором, консервантом и с разной концентрацией синтетического человеческого остеокальцина: А= 0 нг/мл, В=6,7 нг/мл, С=8,1 нг/мл, D=12,8 нг/мл, Е=33,3 нг/мл, F=117,0 нг/мл.
Контроль СО это раствор синтетического человеческого остеокальцина с белковым стабилизатором и консервантом.
Стрипы заклеивались пленкой и инкубировались 120±5 мин при комнатной температуре (18-22°С) без встряхивания.
После этого стрипы 5 раз промывались отмывающим буфером, разбавленным 1:50 дистиллированной водой.
Ячейки полностью осушались перед каждым циклом промывки.
Затем производилась инкубация с хромогенным субстратом.
Внесилось 100 мкл раствора субстрата в каждую ячейку и инкубировалось 15 ±2 мин в темноте при комнатной температуре (18-22°С) без встряхивания, предварительно заклеив стрипы пленкой.
После этого шла остановка цветной реакции, путем добавлялось по 100 мкл раствора 3N HCI.
Далее измерялась оптическая плотность в течение двух часов при 450 нм.
Расчет результатов производился следующим образом.
Рассчитывались средние значения для дублей оптических плотностей за вычетом среднестатистической плотности для стандарта А.
Затем строилась кривая, где по оси ординат

[Back]